Recombinant expression of Intreplicacin from the scorpion Vaejovis intrepidus and its effect on skeletal ryanodine receptors
- 作者
- Leonel Vargas-Jaimes, Liang Xiao, Jing Zhang, Lourival D. Possani, Héctor H. Valdivia, Verónica Quintero-Hernández
- 单位
- Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca, Morelos 62271, México; Department of Marine Biotechnology, Faculty of Naval Medicine, Second Military Medical University, Shanghai, 200433, China; Center for Arrhythmia Research, Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109, USA; CONACYT- Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas- Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Ciudad Universitaria, C.P. 72570, Puebla, México
- 杂志
- BBA - General Subjects（2017）
- DOI
- 10.1016/j.bbagen.2017.01.032
- 所属领域
- 蛋白质工程
- 关键词
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解决的核心问题
蝎毒中钙调素（calcins）来源有限，化学合成繁琐且需要正确折叠，重组表达常需手动氧化，难以高效获得有活性的重组钙调素。本论文旨在建立一种无需手动氧化即能获得有活性重组 Intreplicacin 的异源表达方法，并验证其对骨骼肌 ryanodine 受体（RyR1）的药理活性。
研究策略
将 Intreplicacin 基因与 pelB 信号肽、硫氧还蛋白（Trx）、His 标签及肠激酶切割位点融合，构建 pET-Trx-Intrep 载体，转化大肠杆菌 BL21(DE3) 后诱导表达于周质空间，利用硫氧还蛋白的伴侣活性和周质的氧化环境促进二硫键正确形成；通过 Ni-NTA 亲和层析和 HPLC 纯化融合蛋白，经肠激酶酶切后获得纯重组 Intreplicacin；采用 [3H] ryanodine 结合、脂双层单通道记录和 SR 囊泡 Ca2+ 释放实验评价其活性。
核心内容
本研究建立了一种无需手动氧化即可获得有活性重组钙调素肽Intreplicacin的大肠杆菌异源表达方法。作者将intreplicacin基因与pelB信号肽、硫氧还蛋白、His标签及肠激酶切割位点融合构建pET-Trx-Intrep载体，转化BL21(DE3)后诱导蛋白分泌至周质空间，利用周质的氧化环境和硫氧还蛋白的伴侣活性促进二硫键正确形成。经Ni-NTA亲和层析和HPLC纯化、肠激酶酶切后，获得纯重组Intreplicacin，融合蛋白产量为7.2 mg/L培养物，最终纯化得率0.35 mg。活性评价显示，重组Intreplicacin以剂量依赖方式激活骨骼肌RyR1，表观Kd为17.4 nM，单通道记录中诱导约55%全电导状态的亚电导状态，并在100 nM时刺激SR囊泡释放约48.2%的钙负荷。序列分析表明其与Vejocalcin仅一个氨基酸差异。该表达系统成功产出了药理学效应与天然或化学合成钙调素一致的重组肽，且无需额外氧化步骤，为钙调素家族突变体的制备及结构与功能关系研究提供了高效平台。
创新点
1) 首次在 E. coli 周质中异源表达了有活性的钙调素（calcin）家族肽 Intreplicacin，无需额外手动氧化；2) 利用 pelB 信号肽和硫氧还蛋白融合策略实现了正确折叠和分泌到周质，避免了胞质内二硫键错误形成；3) 提供了可生产钙调素突变体的表达系统，为结构-功能研究奠定基础。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | intreplicacin | Intreplicacin | 调控 | 目标重组肽，能够激活 RyR1 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | trxA | Thioredoxin | 催化 | 融合伴侣，帮助二硫键正确折叠 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 周质分泌 | pelB | PelB signal peptide | 转运 | 引导融合蛋白分泌到周质 |
| 兔骨骼肌重肌浆网囊泡 | 钙信号通路 | — | RyR1（ryanodine receptor 1） | 转运 | Intreplicacin 的靶标，钙释放通道 |
关键发现
- 重组 Intreplicacin 以剂量依赖方式激活骨骼肌 RyR1，表观 Kd =
- 4 ±
- 0 nM；单通道记录中诱导约 55% 全电导状态的亚电导状态（与 Vejocalcin 类似）；刺激 SR 囊泡 Ca2+ 释放的初始剂量为
- 3 ±
- 5 nM，100 nM 时释放约
- 2 ±
- 1% 的 Ca2+ 负荷；融合蛋白产量为
- 2 mg/L 培养物，纯化 Intreplicacin 产量为
- 35 mg；质谱测得融合蛋白分子量
- 1 Da，Intreplicacin 为
- 5 Da（理论
- 4 Da）；序列分析显示 Intreplicacin 与 Vejocalcin 仅 1 个氨基酸差异（K14 vs N14），相似性 97%，与 Imperacalin 相似性最低（69.7%）；Intreplicacin 等电点 pI=9.7，pH
- 0 时净电荷 +6.8，亲水性 55%。
研究结论
成功建立了在大肠杆菌 BL21(DE3) 周质中表达有活性重组 Intreplicacin 的方法，无需手动氧化即可获得正确折叠的肽。重组 Intreplicacin 能高亲和力结合并激活 RyR1，诱发特征性亚电导状态和 SR 钙释放，药理学效应与天然/化学合成的钙调素一致。该表达系统可用于产生钙调素变体，有助于研究钙调素与 RyR 的结构-功能关系。