Engineering of a calcium-ion binding site into the RC-LH1-PufX complex of Rhodobacter sphaeroides to enable ion-dependent spectral red-shifting

作者: David J.K. Swainsbury, Elizabeth C. Martin, Cvetelin Vasilev, Pamela S. Parkes-Loach, Paul A. Loach, C. Neil Hunter
单位: Department of Molecular Biology and Biotechnology, University of Sheffield, Firth Court, Western Bank, Sheffield, S10 2TN, United Kingdom; Department of Molecular Biosciences, Northwestern University, Hogan 2100, 2205 Tech Drive, Evanston, IL 60208, United States
杂志: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics（2017）
DOI: 10.1016/j.bbabio.2017.08.009
所属领域: 代谢工程
关键词: Antenna complexCalcium-ion bindingProtein engineeringReaction centreRhodobacter sphaeroidesThermochromatium tepidum
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解决的核心问题

将嗜热紫色细菌 Thermochromatium tepidum 的 LH1 天线复合物中钙离子结合位点及其伴随的光谱红移和热稳定性功能，移植到中温光合细菌 Rhodobacter sphaeroides 的 RC-LH1-PufX 核心复合物中，同时避免完整交换 LH1 多肽导致的组装缺陷。

研究策略

以 Tch. tepidum 的 LH1 α/β 多肽序列为模板，逐步改造 Rba. sphaeroides 的天然 LH1 多肽，设计 Minimal、Chimeric 和 Tepidum 三个渐进的嵌合/替换突变体，在体内表达并纯化 RC-LH1 复合物，并结合体外重建实验验证钙离子结合和光谱红移功能。

研究路线图

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核心内容

该研究尝试将嗜热紫色细菌Thermochromatium tepidum LH1天线复合物中的钙离子结合位点及其光谱红移功能移植到中温光合细菌Rhodobacter sphaeroides的RC-LH1-PufX核心复合物中，以避免完整交换LH1多肽导致的组装缺陷。作者以Tch. tepidum的LH1 α/β多肽为模板，设计了Minimal、Chimeric和Tepidum三个渐进的嵌合突变体，在体内表达纯化并进行体外重建验证。结果显示，含CaCl2条件下三种构建体的LH1 Qy吸收峰相对于野生型的875 nm分别红移至881 nm、894 nm和916 nm；EDTA去除钙离子后Chimeric蓝移11 nm，而纯化的Tepidum LH1在EDTA下蓝移至830 nm，接近B820亚基状态。钙离子使Chimeric多肽体外重建的LH1形成量提高约3倍，spirilloxanthin可额外红移约7 nm。完整的Tch. tepidum多肽交换虽实现最大红移，但导致LH1与RC解偶联、光合生长减慢约6倍。该研究证明外来天线的钙结合功能模块可通过逐步工程化移植到异源宿主中，但完全功能化还需考虑N端区域和类胡萝卜素类型。

创新点

1. 首次将 Tch. tepidum 的钙离子结合位点工程化引入 Rba. sphaeroides LH1 天线；2. 证明 Tch. tepidum LH1 α/β 的 C 端结构域可作为自主模块，赋予外来天线复合物钙离子结合和吸收红移能力；3. 发现钙离子结合与 RC 组装可分离，完整的核心复合物是钙离子依赖性光谱切换的前提；4. 通过体外重建证明 spirilloxanthin 类胡萝卜素可增强 LH1 形成并引起 BChl Qy 带额外红移约 7 nm。

研究对象（6）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Rhodobacter sphaeroides	光合作用 RC-LH1-PufX 核心复合物	pufB, pufA	LH1 β 多肽 (PufB), LH1 α 多肽 (PufA)	催化	天然 LH1 多肽，被工程化改造以引入钙离子结合位点
Thermochromatium tepidum	光合作用 LH1 天线复合物	pufB, pufA	LH1 β 多肽, LH1 α 多肽	调控	提供钙离子结合位点的模板序列，其 C 端结构域被引入 Rba. sphaeroides
Rhodobacter sphaeroides	光合作用 RC-LH1-PufX 核心复合物	pufX	PufX	转运	形成醌通道，在 Chimeric 和 Tepidum 纯化复合物中缺失，可能与 α C 端交换有关
Rhodobacter sphaeroides	类胡萝卜素生物合成	crtA, crtB 等（推测）	Spheroidene 类胡萝卜素	调控	Rba. sphaeroides 天然类胡萝卜素，体外添加对 Chimeric LH1 形成无促进
Thermochromatium tepidum	类胡萝卜素生物合成	crtC, crtD 等（推测）	Spirilloxanthin 类胡萝卜素	调控	Tch. tepidum 天然类胡萝卜素，体外可增强 Chimeric LH1 形成并产生额外红移
Rhodobacter sphaeroides / Thermochromatium tepidum	光合作用 LH1 天线	无（蛋白工程改造）	BChl a (Bacteriochlorophyll a)	催化	LH1 结合的色素，吸收红移的载体

关键发现

在含 CaCl2 的膜中，Minimal、Chimeric 和 Tepidum 构建体的 LH1 Qy 吸收峰相对于 WT (875 nm) 分别红移 6 nm、19 nm 和 41 nm，达到 881 nm、894 nm 和 916 nm
加入 EDTA 去除钙离子后，Minimal 和 Chimeric 的 Qy 分别蓝移 1 nm 和 11 nm，而 Tepidum 膜仅蓝移 3 nm（至 913 nm）
纯化的 Tepidum LH1 在 CaCl2 下 Qy 为 915 nm，但 EDTA 处理下蓝移至 830 nm（接近 B820 亚基）
纯化 Chimeric LH1 在 CaCl2 下 Qy 为 885 nm，EDTA 下蓝移至 863 nm，而 Minimal 纯化复合物在两种条件下均为 875 nm
钙离子使 Chimeric 多肽体外重建的 LH1 型复合物形成量提高约 3 倍
添加 spirilloxanthin 使 Chimeric 体外重建的 LH1 Qy 进一步红移约 7 nm（至约 866 nm 基础上增加）
Tepidum 构建体表达量显著下降，光合生长速度比 WT 慢约 6 倍（达到 OD680≈1.8 所需时间约为 WT 的 6 倍）
纯化的 Tepidum LH1 荧光寿命为 842 ps，而 WT 纯化复合物为 295 ps，表明其与 RC 能量传递受损
钙离子结合亲和力试验中，Chimeric 复合物在
16–48 μM CaCl2 范围内表现出浓度依赖的红移。

研究结论

通过逐步引入 Tch. tepidum LH1 α/β 多肽的 C 端结构域，可以在 Rba. sphaeroides LH1 中成功建立功能性钙离子结合位点，使吸收峰发生离子依赖性红移，同时保留与 RC 的组装能力。完整的 Tch. tepidum LH1 多肽交换会破坏核心复合物组装，导致 LH1 与 RC 解偶联。研究证明外来天线复合物的功能模块（钙离子结合和光谱切换）可通过精心设计移植到异源宿主中，但氮端区域和类胡萝卜素类型也对完全红移和稳定性具有贡献。