Assembly of functional photosystem complexes in Rhodobacter sphaeroides incorporating carotenoids from the spirilloxanthin pathway
- 作者
- Shuang C. Chi, David J. Mothersole, Preston Dilbeck, Dariusz M. Niedzwiedzki, Hao Zhang, Pu Qian, Cvetelin Vasilev, Katie J. Grayson, Philip J. Jackson, Elizabeth C. Martin, Ying Li, Dewey Holten, C. Neil Hunter
- 单位
- Department of Molecular Biology and Biotechnology, University of Sheffield; Department of Chemistry, Washington University; CHELSI Institute, Department of Chemical and Biological Engineering, University of Sheffield; Department of Microbiology and Immunology, China Agricultural University; Photosynthetic Antenna Research Center, Washington University
- 杂志
- Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics（2014）
- DOI
- 10.1016/j.bbabio.2014.10.004
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过基因组替换将非内源的螺旋藻黄素途径类胡萝卜素引入Rhodobacter sphaeroides，并评估这些类胡萝卜素对光合色素蛋白复合物（LH2和RC-LH1-PuFX）组装及能量传递效率的影响。
研究策略
利用pK18mobsacB质粒进行基因组无缝编辑，将内源三步八氢番茄红素脱饱和酶（CrtI）替换为Pantoea agglomerans的四步酶，并组合敲除crtC、crtA或引入crtD Ga突变，构建产生番茄红素、玫红品、螺旋藻黄素和2,2'-二酮-螺旋藻黄素等不同共轭长度类胡萝卜素的系列突变菌株；通过蔗糖密度梯度离心分离LH2和RC-LH1-PuFX复合物，结合HPLC、质谱和荧光光谱分析其色素组成与能量传递效率。
核心内容
该研究通过基因组无缝编辑策略，将Rhodobacter sphaeroides内源的八氢番茄红素脱饱和酶CrtI替换为Pantoea agglomerans的四步酶，并结合敲除crtC、crtA或引入crtD突变，系统构建了五种携带非天然类胡萝卜素（番茄红素、玫红品、螺旋藻黄素及2,2'-二酮-螺旋藻黄素）的突变菌株。通过蔗糖密度梯度离心分离LH2和RC-LH1-PuFX复合物，结合HPLC、质谱与荧光光谱分析，发现所有非天然类胡萝卜素均能被光合色素蛋白复合物组装途径高效接纳。能量传递效率随类胡萝卜素共轭双键数增加呈梯度下降：神经孢烯（N=9）为94%，番茄红素（N=11）降至64%，螺旋藻黄素（N=13）为39%，而2,2'-二酮-螺旋藻黄素（N=15）仅35%。此外，LH2复合物中类胡萝卜素与细菌叶绿素的比值在0.35–0.50之间。这些结果表明光合复合物对类胡萝卜素结构具有显著耐受性，建立的系列菌株为深入研究类胡萝卜素构象、激发态动力学及能量传递机制提供了理想的体内实验平台。
创新点
["首次在Rhodobacter sphaeroides中实现基因组无缝替换crtI，使内源途径转向螺旋藻黄素途径，并在半有氧条件下产生2,2'-二酮-螺旋藻黄素。", '系统构建了五种携带非天然类胡萝卜素的新菌株，证明LH2和RC-LH1-PuFX组装途径能容忍不同共轭长度的类胡萝卜素。', "揭示类胡萝卜素到细菌叶绿素的能量传递效率随共轭双键数增加而梯度下降的规律，并扩展至N=15的2,2'-二酮-螺旋藻黄素。"]
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodobacter sphaeroides | 类胡萝卜素生物合成（spheroidene/spirilloxanthin途径） | crtI | 八氢番茄红素脱饱和酶（phytoene desaturase） | 催化 | 将内源三步CrtI替换为P. agglomerans四步酶（crtI^Pa），使途径转向spirilloxanthin系列 |
| Rhodobacter sphaeroides | 类胡萝卜素生物合成（spheroidene/spirilloxanthin途径） | crtC | 八氢番茄红素加氧酶/羟化酶（CrtC） | 催化 | 敲除crtC使途径积累lycopene |
| Rhodobacter sphaeroides | 类胡萝卜素生物合成（spheroidene/spirilloxanthin途径） | crtD | 甲氧基神经孢烯脱氢酶（CrtD） | 催化 | 引入crtD^Ga突变（C259T提前终止）使途径积累rhodopin等中间产物 |
| Rhodobacter sphaeroides | 类胡萝卜素生物合成（spheroidene/spirilloxanthin途径） | crtA | 球形烯单加氧酶/螺旋藻黄素单加氧酶（CrtA） | 催化 | 在半有氧条件下将spirilloxanthin氧化为2,2'-diketo-spirilloxanthin；敲除crtA导致spheroidene积累并提高RC-LH1-PuFX二聚体比例 |
| Rhodobacter sphaeroides | 类胡萝卜素生物合成（spheroidene/spirilloxanthin途径） | crtF | O-甲基转移酶（CrtF） | 催化 | 参与spirilloxanthin途径的甲基化修饰，文中推测CrtF催化rhodopin的甲基化 |
| Rhodobacter sphaeroides | 光合作用光捕获复合物 | — | LH2复合物（α/β多肽及B800/B850 BChl） | 调控 | 类胡萝卜素是LH2稳定组装所必需，非天然类胡萝卜素可被容纳 |
| Rhodobacter sphaeroides | 光合作用光捕获复合物 | pufX | PufX（RC-LH1复合物亚基） | 调控 | 参与RC-LH1-PuFX二聚体形成；不同类胡萝卜素影响二聚体比例 |
关键发现
- 类胡萝卜素到细菌叶绿素的能量传递效率：neurosporene (N=9) 94%，spheroidene (N=10) 96%，spheroidenone (N=11) 95%，lycopene (N=11) 64%，rhodopin (N=11) 62%，spirilloxanthin (N=13) 39%，2,2'-diketo-spirilloxanthin (N=15) 35%。LH2复合物中类胡萝卜素:BChl比值为0.35-0.50（如lycopene
- 36，rhodopin
- 35，spirilloxanthin
- 45，2,2'-diketo-spirilloxanthin
- 46）。RC-LH1-PuFX二聚体比例在ΔcrtA菌株中可达82%，在含spirilloxanthin的菌株中显著升高。
研究结论
所有非天然类胡萝卜素（番茄红素、玫红品、螺旋藻黄素、2,2'-二酮-螺旋藻黄素）均能被Rba. sphaeroides的LH2和RC-LH1-PuFX复合物组装途径高效接纳，且能量传递效率随着类胡萝卜素共轭长度增加而下降；这些新菌株为研究类胡萝卜素构象、激发态动力学及能量传递机制提供了理想的体内实验平台。