Comparative functional characterization of eugenol synthase from four different Ocimum species: Implications on eugenol accumulation
- 作者
- Atul Anand, Ramesha H. Jayaramaiah, Supriya D. Beedkar, Priyanka A. Singh, Rakesh S. Joshi, Fayaj A. Mulani, Bhushan B. Dholakia, Sachin A. Punekar, Wasudeo N. Gade, Hirekodathakallu V. Thulasiram, Ashok P. Giri
- 单位
- CSIR-National Chemical Laboratory, Pune; Savitribai Phule Pune University; Institute of Bioinformatics and Biotechnology, Savitribai Phule Pune University; Biospheres, Pune; CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, New Delhi
- 杂志
- Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics（2017）
- DOI
- 10.1016/j.bbapap.2016.08.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析不同罗勒属（Ocimum）物种中丁子香酚合酶（EGS）的功能差异及其对丁子香酚积累的影响，以及EGS底物选择性的分子机制。
研究策略
对五个Ocimum物种的不同组织进行苯丙烷类代谢物谱分析和EGS/CFAT/EOMT基因表达分析；从四个物种克隆EGS，在大肠杆菌中异源表达并纯化，进行酶动力学表征；利用同源建模和分子对接分析底物结合差异。
核心内容
该研究系统比较了四种罗勒属植物丁子香酚合酶（EGS）的功能差异，并解析了其底物选择性的分子机制。作者对五个罗勒物种的不同组织进行了苯丙烷类代谢物谱分析和相关基因表达分析，从四个物种中克隆EGS基因，在大肠杆菌中异源表达纯化后进行酶动力学表征，并结合同源建模和分子对接分析底物结合差异。结果显示，OgI幼叶中丁子香酚含量高达15106 ng/g FW，且EGS表达水平与丁子香酚积累正相关。酶动力学表明，OgIEGS对coniferyl acetate的催化效率（kcat/Km=1.36 mM⁻¹min⁻¹）显著高于coumaryl acetate（0.16），其他物种EGS也一致偏好coniferyl acetate。分子对接进一步揭示Lys132等活性位点残基对底物偏好起关键作用，OgIEGS与coniferyl acetate的结合能（-7.6 kcal/mol）优于其他底物。该研究首次系统阐明了EGS底物选择性的酶学基础，证明coniferyl acetate是EGS的优先底物，其动力学参数与丁子香酚积累正相关，同时CFAT和EOMT的表达差异也参与调控代谢物组成，为罗勒属植物丁子香酚生物合成的代谢工程改造提供了理论依据。
创新点
首次系统比较了四个Ocimum物种EGS的酶学特性，结合代谢物和表达数据证明了coniferyl acetate是EGS的优先底物；通过分子对接揭示了Lys132等活性位点残基对底物偏好的贡献。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 Rosetta 2 (DE3) | 苯丙烷类生物合成途径 | EGS（来自Ocimum gratissimum、O. tenuiflorum、O. kilimandscharicum、O. basilicum） | 丁子香酚合酶（Eugenol synthase） | 催化 | 异源表达、纯化并进行了酶动力学表征，催化coniferyl acetate和coumaryl acetate分别生成丁子香酚和佳味酚 |
| Ocimum植物组织 | 苯丙烷类生物合成途径 | CFAT（coniferyl alcohol acyl transferase） | 松柏醇酰基转移酶 | 催化 | 表达水平与丁子香酚积累正相关，在丁子香酚含量高的物种中转录水平较高 |
| Ocimum植物组织 | 苯丙烷类生物合成途径 | EOMT（eugenol O-methyltransferase） | 丁子香酚O-甲基转移酶 | 催化 | 仅在O. tenuiflorum中高表达，与丁子香酚甲醚的积累相关 |
关键发现
- 在OgI幼叶中丁子香酚含量高达15106 ng/g FW，OgII幼叶为14942 ng/g FW
- 丁子香酚甲醚仅在O. tenuiflorum中检出，OtI幼叶为5653 ng/g FW，OtII为7320 ng/g FW。EGS表达水平与丁子香酚积累正相关，幼叶和花序表达最高。OgIEGS对coniferyl acetate的Km为0.5 mM，kcat为0.68 min-1，kcat/Km为1.36 mM-1 min-1
- 对coumaryl acetate的Km为1.25 mM，kcat为0.2017 min-1，kcat/Km为0.16。OtIEGS对coniferyl acetate的Km为1.17 mM，kcat为1.68 min-1，kcat/Km为1.44
- OkEGS对coniferyl acetate的Km为0.41 mM，kcat为0.18 min-1，kcat/Km为0.44
- ObalEGS对coniferyl acetate的Km为0.7 mM，kcat为0.23 min-1，kcat/Km为0.33，且对coumaryl acetate无活性。分子对接显示OgIEGS与coniferyl acetate结合能为-7.6 kcal/mol，优于coumaryl acetate（-7.3）和cinnamyl acetate（-7.0）。EGS ORF长945 bp，编码314个氨基酸，分子量约36 kDa。
研究结论
EGS的表达水平和酶动力学参数与丁子香酚积累正相关，coniferyl acetate是EGS的优先底物，使丁子香酚含量高于佳味酚；CFAT和EOMT的表达差异也参与调控苯丙烷类代谢物组成。