A combination of site-directed mutagenesis and chemical modification to improve diastereopreference of Pseudomonas alcaligenes lipase
- 作者
- Chen Hui, Wu Jianping, Yang Lirong, Xu Gang
- 单位
- Institute of Biological Engineering, Department of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, 310027 Hangzhou, China
- 杂志
- Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics（2013）
- DOI
- 10.1016/j.bbapap.2013.08.011
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高Pseudomonas alcaligenes脂肪酶在薄荷醇丙酸酯手性拆分中的非对映选择性
研究策略
将定点突变与化学修饰相结合：在柔性热点Ala272处引入半胱氨酸（A272C），再用DTNB对巯基进行共价修饰，形成大体积修饰基团，增强活性位点附近的空间排斥和结构刚性
核心内容
针对 Pseudomonas alcaligenes 脂肪酶在薄荷醇丙酸酯手性拆分中非对映选择性不足的问题，本研究将定点突变与化学修饰相结合进行酶改造。策略上，在柔性热点 Ala272 处引入半胱氨酸（A272C），随后用 DTNB 对巯基进行共价修饰，在活性位点附近引入大体积基团以增强空间排斥和结构刚性。结果显示，野生型酶催化消旋底物时 L-薄荷醇的 de 值仅 35%，A272F 和 A272C 突变体分别提升至 54% 和 68%，而 A272C-DTNB 修饰酶在底物转化率近 100% 时 de 值达到 90%。动力学分析表明，修饰酶对 L-新薄荷醇丙酸酯的 Km 从 1.57 mM 升至 15.29 mM，催化效率较野生型下降 2243 倍，但对目标 L-薄荷醇丙酸酯仅下降 35 倍，说明其通过选择性排斥非目标底物来提升选择性。这项工作证明了定点突变与化学修饰协同作用能突破天然氨基酸侧链大小的限制，为脂肪酶非对映选择性的精准调控提供了新策略。
创新点
首次将定点突变与化学修饰结合应用于脂肪酶非对映选择性改造；通过引入非天然大体积化学基团突破天然氨基酸侧链大小的限制；通过MD模拟和动力学参数揭示空间排斥与结构刚性的协同机制
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 脂肪酶异源表达 | pal | 野生型PAL | 催化 | 重组表达用于水解消旋薄荷醇丙酸酯，de_p为35% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 脂肪酶异源表达 | pal(A272C) | A272C-DTNB修饰PAL | 催化 | 定点突变引入Cys272后经DTNB修饰，de_p提高到90% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 脂肪酶异源表达 | pal(A272F) | A272F突变PAL | 催化 | 单纯定点突变对照，de_p为54% |
关键发现
- 野生型PAL催化消旋薄荷醇丙酸酯水解时，L-薄荷醇的de_p为35%
- A272F突变体为54%
- A272C突变体为68%
- A272C-DTNB修饰后提高到90%（底物转化率近100%）。动力学参数显示，A272C-DTNB修饰酶对L-新薄荷醇丙酸酯的Km从1.57 mM升至15.29 mM，对D-异新薄荷醇丙酸酯的Km从2.35 mM升至9.17 mM
- 催化效率Kcat/Km分别较野生型下降2243倍和174倍，而对L-薄荷醇丙酸酯仅下降35倍。
研究结论
结合定点突变和化学修饰可有效改变蛋白质性质，通过空间排斥和结构刚性的协同作用提高脂肪酶的非对映选择性，是一种有效的蛋白质改造策略。