CYP106A2 - a versatile biocatalyst with high potential for biotechnological production of selectively hydroxylated steroid and terpenoid compounds
- 作者
- Daniela Schmitz, Simon Janocha, Flora Marta Kiss, Rita Bernhardt
- 单位
- Department of Biochemistry, Saarland University, Campus B2.2, 66123 Saarbruecken, Germany
- 杂志
- BBA - Proteins and Proteomics（2017）
- DOI
- 10.1016/j.bbapap.2017.07.011
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用CYP106A2实现甾体和萜类化合物的选择性羟基化，并提高其活性与选择性以满足工业生物技术生产需求？
研究策略
综述CYP106A2的底物谱、全细胞生物转化系统开发及蛋白质工程（理性设计与定向进化）方面的研究进展。
核心内容
CYP106A2是一种源自巨大芽孢杆菌的细胞色素P450单加氧酶，能够催化甾体和萜类化合物的选择性羟基化。本综述系统总结了该酶在底物谱扩展、全细胞生物转化系统开发以及蛋白质工程改造方面的研究进展。研究者建立了基于大肠杆菌和巨大芽孢杆菌的全细胞催化体系，其中大肠杆菌系统转化孕酮和睾酮的时空产率分别达到3.7 g/L/d和5.5 g/L/d，巨大芽孢杆菌体系中脱氢表雄酮的7β-羟基化选择性达90%，时空产率为2.7 g/L/d。通过运用FpR-Adx电子传递系统，初始反应速率提高33%；使用粗细胞提取物使反应活性提高6倍，总体产率提高18倍。蛋白质工程方面，突变体T89N/A395I将11α-羟基孕酮选择性从27.7%提升至80.9%，A243S突变使6β-羟基孕酮占比从野生型的8.7%升至82.7%。这些结果表明，结合全细胞催化与定向进化策略，CYP106A2已具备接近工业应用水平的催化性能，有望替代化学法实现甾体药物的绿色生物制造。
创新点
将CYP106A2鉴定为首个具有区域选择性的细菌烯丙基二萜羟化酶；扩展底物谱至三萜酸类；建立大肠杆菌和巨大芽孢杆菌全细胞系统；通过蛋白质工程改造将羟基化选择性从15β转变为11α、6β等。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甾体羟化 | CYP106A2 | CYP106A2 | 催化 | 重组表达CYP106A2，用于全细胞转化孕酮、睾酮、DOC等 |
| Bacillus megaterium ATCC13368 | 甾体/萜类羟化 | CYP106A2 | CYP106A2 | 催化 | 天然宿主，表达CYP106A2转化DHEA、乳香酸等 |
| Bacillus megaterium MS941 | 甾体/萜类羟化 | CYP106A2 | CYP106A2 | 催化 | 重组表达并共表达牛肾上腺电子传递蛋白，用于DHEA和环丙孕酮转化 |
| Escherichia coli | 电子传递 | AdR | 肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶 | 能量供给 | 来自牛肾上腺，为CYP106A2提供电子 |
| Escherichia coli | 电子传递 | Adx4-108 | 肾上腺皮质铁氧还蛋白（截短型） | 能量供给 | 截短型铁氧还蛋白，电子转移效率更高 |
| Escherichia coli | 电子传递 | FpR | 黄素蛋白还原酶 | 能量供给 | 来自大肠杆菌的替代还原酶，与Adx组成新型电子传递系统 |
| Lactobacillus brevis | 辅因子再生 | LbADH | 醇脱氢酶 | 能量供给 | 用于NADPH再生，提高全细胞转化效率 |
关键发现
- 大肠杆菌全细胞系统转化脱氧皮质酮（DOC）的转化率达1 mM/d，理论时空产率0.33 g/L/d
- 经优化后孕酮和睾酮的时空产率分别达3.7 g/L/d和5.5 g/L/d。使用粗细胞提取物使反应活性提高6倍，总体产率提高18倍。使用FpR-Adx电子传递系统使初始反应速率提高33%。在巨大芽孢杆菌中，DHEA的7β-羟基化选择性达90%，时空产率115 mg/L/h（2.7 g/L/d）。环丙孕酮醋酸盐在400 mL规模下转化率近完全，产物浓度0.43 g/L。突变体A395L使11α-羟基孕酮比例从9%提高到39%，9α-羟基孕酮从4%到20%
- 突变体T89N/A395I使11α-羟基孕酮选择性从27.7%提高到80.9%，产物8 mg/L
- 突变F165L/A395E/G397V使9α-羟基孕酮提高10倍
- 突变A243S使6β-羟基孕酮占82.7%（野生型8.7%）。最高催化效率(kcat/Km)达200×10^3 M^-1 s^-1
- 甾体羟化Vmax达400 nmol/min/nmol P450，萜烯约100 nmol/min/nmol P450。
研究结论
CYP106A2是一种具有广阔应用前景的多功能生物催化剂，通过蛋白质工程可有效改变其羟基化选择性，全细胞系统结合过程优化已接近工业规模要求，有望替代化学法用于甾体/萜类药物的绿色生产。