Preliminary assessment of the C13-side chain 2'-hydroxylase involved in Taxol biosynthesis
- 作者
- Robert M. Long, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, WA 99164-6340, USA
- 杂志
- Biochemical and Biophysical Research Communications（2005）
- DOI
- 10.1016/j.bbrc.2005.08.119
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
确定紫杉醇生物合成中C13侧链2'-羟基化步骤发生的时机，即该羟基化发生在β-苯丙氨酸转移到baccatin III之前还是之后。
研究策略
利用Taxus悬浮细胞的无细胞酶系统（可溶部分和微粒体部分），以[13-3H]N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇、[3H]2'-脱氧紫杉醇和[14C]β-苯丙氨酸为底物进行酶活检测，通过放射性HPLC分析产物，并利用CO、咪康唑和克霉唑等抑制剂及辅因子依赖实验表征酶的性质。
核心内容
该研究利用Taxus × media悬浮细胞的无细胞酶系统，初步鉴定了紫杉醇生物合成中C13侧链2'-羟基化反应的关键酶学特征与反应时序。研究者以放射性标记的N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇、2'-脱氧紫杉醇和β-苯丙氨酸为底物，结合微粒体与可溶部分进行酶活检测，并通过抑制剂实验和辅因子依赖分析表征酶的性质。结果显示，微粒体制备物能在NADPH和氧气存在下将N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇羟基化为N-去苯甲酰紫杉醇，比活性约为1 nmol/h/mg蛋白质，相当于阳性对照紫杉二烯5α-羟化酶活性的五分之一；而β-苯丙氨酸和2'-脱氧紫杉醇均不被羟基化。该反应严格依赖氧、NADPH、FAD和FMN，且能被CO及100 μM咪康唑或克霉唑完全抑制（活性降至0.1 nmol/h/mg以下），Fe²⁺/α-酮戊二酸体系不能替代。进一步发现，羟基化产物可被残留转移酶转化为紫杉醇、cephalomannine等终产物。这些证据首次明确表明，2'-羟基化由微粒体细胞色素P450酶催化，且发生在侧链转移至baccatin III之后、N-苯甲酰化之前，从而确定了C13侧链组装的完整顺序：β-苯丙氨酸形成并转移后，经P450羟化，再经苯甲酰化生成紫杉醇。该工作为后续克隆2'-羟化酶基因奠定了基础。
创新点
首次提供直接证据表明紫杉醇C13侧链2'-羟基化由微粒体细胞色素P450酶催化，且该反应发生在侧链转移之后、N-苯甲酰化之前，明确了侧链组装的顺序。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Taxus × media cv Hicksi (cell line Mh00D) 悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成 | — | 苯丙氨酸氨基变位酶 | 催化 | 先前已克隆，催化α-苯丙氨酸异构化为β-苯丙氨酸。 |
| Taxus × media cv Hicksi (cell line Mh00D) 悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成 | — | C13苯丙烷侧链-CoA酰基转移酶 | 催化 | 先前已克隆，催化β-苯丙氨酰CoA转移至baccatin III的C13羟基，生成N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇。 |
| Taxus × media cv Hicksi (cell line Mh00D) 悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成 | — | N-苯甲酰转移酶 | 催化 | 先前已克隆，催化N-去苯甲酰紫杉醇的N-苯甲酰化，是紫杉醇生物合成最后一步。 |
| Taxus × media cv Hicksi (cell line Mh00D) 悬浮细胞 | 紫杉醇生物合成 | — | 侧链2'-羟化酶（细胞色素P450） | 催化 | 本研究初步表征，定位于微粒体，催化N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇的2'-羟基化，基因尚未克隆。 |
关键发现
- 在Taxus × media悬浮细胞微粒体制备中，N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇在NADPH/O2存在下被羟基化为N-去苯甲酰紫杉醇，比活性约1 nmol/h/mg微粒体蛋白，约为阳性对照紫杉二烯5α-羟化酶（5 nmol/h/mg）的1/5
- 而β-苯丙氨酸和2'-脱氧紫杉醇不被羟基化
- 该活性绝对依赖O2、NADPH、FAD和FMN，并被CO、100 μM咪康唑或克霉唑完全抑制（活性低于0.1 nmol/h/mg）
- Fe2+/α-酮戊二酸/抗坏血酸不能支持反应。此外，羟基化产物N-去苯甲酰紫杉醇可被微粒体中残留的转移酶进一步转化为紫杉醇、cephalomannine和taxol C。
研究结论
这些结果支持紫杉醇C13侧链组装顺序为：苯丙氨酸氨基变位酶催化α-苯丙氨酸转化为β-苯丙氨酸，后者经CoA连接酶活化后由C13侧链转移酶转移至baccatin III生成N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇，随后由细胞色素P450 2'-羟化酶催化生成N-去苯甲酰紫杉醇，最后经N-苯甲酰转移酶生成紫杉醇。该研究为克隆编码2'-羟化酶的P450基因奠定了基础。