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Molecular cloning and characterization of a cytochrome P450 taxoid 9α-hydroxylase in Ginkgo biloba cells

作者
Nan Zhang, Zhentai Han, Guiling Sun, Angela Hoffman, Iain W. Wilson, Yanfang Yang, Qian Gao, Jianqiang Wu, Dan Xie, Jungui Dai, Deyou Qiu
单位
State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, The Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; Key Laboratory of Forest Ecological Environment of Ministry of Forestry, Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; Key Laboratory of Economic Plants and Biotechnology, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China; Department of Chemistry, University of Portland, Portland, OR 97203, USA; CSIRO Plant Industry, PO Box 1600, Canberra, ACT 2001, Australia; State Key Laboratory of Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
杂志
Biochemical and Biophysical Research Communications（2013）
DOI
10.1016/j.bbrc.2013.12.104
所属领域
代谢工程
关键词
CYP450Cell-free protein synthesis systemGinkgo bilobaLC-MSTaxoid 9α-hydroxylaseTaxol
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解决的核心问题

红豆杉中编码紫杉烷9α-羟化酶的基因难以直接克隆，且该酶在紫杉醇生物合成中至关重要；需要从替代来源（银杏）中鉴定该酶基因。

研究策略

利用银杏悬浮细胞具备紫杉烷9α-羟化活性的特性，通过转录组测序和生物信息学比对筛选候选CYP450基因，采用体外小麦胚芽无细胞蛋白合成系统表达候选蛋白，以LC-MS检测其催化紫杉烷底物sinenxan A的9α-羟化活性。

研究路线图

100%
研究问题：红豆杉9α-羟化酶基因难以直接克隆
策略：银杏悬浮细胞转录组筛选候选CYP450基因
关键改造1：无细胞蛋白合成系统表达候选蛋白
关键改造2：LC-MS检测催化活性（底物SIA）
结果1：筛选325条候选序列；KF773141具有9α-羟化活性
结果2：KF773140无活性；产率接近70%
结论：鉴定GbCYP716B为紫杉烷9α-羟化酶，助力紫杉醇半合成
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核心内容

本研究从银杏悬浮细胞转录组中筛选与红豆杉紫杉醇生物合成相关的细胞色素P450候选序列，得到325条相似序列，并选取两个候选基因进行功能验证。其中KF773141（GbCYP716B）开放阅读框长1458 bp，编码485个氨基酸，预测分子量约55 kDa，而KF773140（GbCYP725A）ORF长1512 bp，编码503个氨基酸。利用小麦胚芽无细胞蛋白合成系统表达候选蛋白，产物浓度约150 ng/μl，随后以LC-MS检测其对底物sinenxan A的催化活性。结果显示KF773141催化产物的保留时间（31.86 min）与标准品9OH-SIA（31.84 min）一致，证实其具有紫杉烷9α-羟化酶活性；而KF773140无此活性。已知银杏悬浮细胞转化SIA至9OH-SIA的产率接近70%。该研究首次鉴定出CYP716B亚家族成员GbCYP716B具备紫杉烷9α-羟化功能，为从红豆杉中直接克隆相应基因及紫杉醇半合成提供了关键线索和可行策略。

创新点

首次鉴定CYP716B亚家族成员GbCYP716B具有紫杉烷9α-羟化酶活性；利用无细胞蛋白合成系统结合LC-MS在体外验证了银杏中该酶的催化功能；为从红豆杉中克隆9α-羟化酶基因提供了重要线索。

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Ginkgo biloba悬浮细胞 紫杉醇生物合成 KF773141 (GbCYP716B) 细胞色素P450 紫杉烷9α-羟化酶 催化 催化底物sinenxan A在C9位发生α-羟基化生成9OH-SIA；属于CYP716B亚家族，该亚家族首次被功能表征
Ginkgo biloba悬浮细胞 紫杉醇生物合成 KF773140 (GbCYP725A) 细胞色素P450（CYP725A亚家族） 催化 在体外无9α-羟化酶活性

关键发现

  1. 从银杏转录组中筛选到325条与红豆杉紫杉醇生物合成P450相似的序列
  2. 候选基因KF773141（GbCYP716B）ORF长1458 bp，编码485个氨基酸，预测分子量54842 Da
  3. KF773140（GbCYP725A）ORF长1512 bp，编码503个氨基酸，预测分子量57202 Da
  4. 无细胞表达产物浓度约150 ng/μl，蛋白大小约55 kDa
  5. LC-MS显示KF773141催化产物保留时间31.86 min与标准品9OH-SIA（31.84 min）一致，而KF773140无活性。银杏悬浮细胞转化SIA到9OH-SIA的报道产率接近70%。

研究结论

本研究成功鉴定了银杏中一个编码紫杉烷9α-羟化酶的细胞色素P450基因GbCYP716B（KF773141），该酶可催化sinenxan A的C9位α-羟基化，将有助于推动紫杉醇半合成及从红豆杉中克隆相应的9α-羟化酶基因。