Comparative genomic and proteomic analyses of Clostridium acetobutylicum Rh8 and its parent strain DSM 1731 revealed new understandings on butanol tolerance
- 作者
- Guanhui Bao, Hongjun Dong, Yan Zhu, Shaoming Mao, Tianrui Zhang, Yanping Zhang, Zugen Chen, Yin Li
- 单位
- CAS Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences; University of Chinese Academy of Sciences; Department of Human Genetics, School of Medicine, University of California, Los Angeles; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences
- 杂志
- Biochemical and Biophysical Research Communications（2014）
- DOI
- 10.1016/j.bbrc.2014.07.052
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
丁醇毒性是丁醇发酵的主要瓶颈，但丁醇耐受性的遗传基础和分子机制尚不清楚。本研究旨在通过比较基因组学和蛋白质组学揭示耐丁醇突变株Rh8的耐受机制。
研究策略
对耐丁醇突变株C. acetobutylicum Rh8及其亲本DSM 1731进行全基因组测序和比较基因组分析，结合已发表的细胞质和膜蛋白质组数据，分析基因组突变与蛋白质表达差异之间的关联，并通过Rchange算法评估rRNA突变对热力学性质的影响。
核心内容
本研究对耐丁醇突变株丙酮丁醇梭菌Rh8及其亲本DSM 1731进行了全基因组测序与比较基因组分析，并结合已发表的蛋白质组数据探究丁醇耐受性的分子机制。Rh8可耐受19 g/L丁醇，较亲本提高46%。基因组比较共鉴定出67个单核苷酸变异、2个插入位点和4个缺失位点，其中29个SNVs位于编码序列影响21个蛋白，22个SNVs分布于12个rRNA基因（覆盖8个rRNA操纵子），其余位于启动子及基因间隔区。值得注意的是，蛋白质组中差异表达蛋白的对应基因均无突变，提示表达变化可能源于上游调控或rRNA层面的变异。Rchange算法分析表明，rRNA突变可显著改变核糖体RNA的热力学特性，例如SMB_r026中38位C→A突变导致熵变2.26、内能变7.73、自由能变5.46。该结果首次在基因组水平系统揭示了rRNA高频突变与丁醇耐受性的关联，提出通过调节翻译过程增强微生物胁迫耐受性的新机制，为菌株耐受性改造提供了rRNA及翻译相关因子的新靶点。
创新点
首次在基因组水平系统分析耐丁醇突变株的突变谱，发现高比例rRNA基因突变，提出通过调节翻译过程提高丁醇耐受性的新机制。
研究对象（22）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 丁醇耐受 | SMB_G0260 (glnB) | 氮调节蛋白PII | 调控 | 氮代谢调控，含I115T错义突变和R114*无义突变 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 代谢 | SMB_G3292 | 乙酰转移酶 | 催化 | E127K错义突变 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | DNA重组 | SMB_G1982 | 位点特异性重组酶 | 催化 | P574L错义突变 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | DNA修复 | SMB_G2708 (ligA) | NAD依赖性DNA连接酶 | 催化 | S470R错义突变 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 硫酸盐转运 | SMB_G0109 | 硫酸盐ABC转运蛋白通透酶 | 转运 | D98N错义突变，位于TauC功能域 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 寡肽转运 | SMB_G3682 | 寡肽ABC转运蛋白 | 转运 | T210I错义突变，位于H-loop区域附近 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 细胞壁合成 | SMB_G1268 | 青霉素结合蛋白 | 催化 | T494P错义突变，参与肽聚糖合成 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 细胞被膜 | SMB_G3599 | S层蛋白 | 区室化 | D280H和G282A错义突变，细胞被膜组分 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 趋化信号转导 | SMB_G0441 | 甲基趋化蛋白(MCP) | 调控 | N61T错义突变，参与胞外信号感知 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 趋化/细胞粘附 | SMB_G3315 | 含ChW重复的表面蛋白 | 区室化 | V204G错义突变 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 鞭毛运动 | SMB_G2198 (flgB) | 鞭毛基体杆蛋白FlgB | 区室化 | V4M错义突变 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 翻译 | SMB_G1210 | 23S rRNA(腺嘌呤2503-C2)-甲基转移酶 | 催化 | C78W错义突变，影响rRNA修饰 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 翻译（核糖体） | SMB_r002, SMB_r005, SMB_r008, SMB_r010, SMB_r014, SMB_r019, SMB_r020, SMB_r023, SMB_r026, SMB_r027 等12个rRNA基因 | 16S/23S/5S核糖体RNA | 调控 | 22个SNVs分布于rRNA基因，可能改变rRNA热力学特性，影响翻译强度 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 孢子形成调控 | spo0A | Spo0A（主调控因子） | 调控 | 上游区域存在SNV（距起始密码子6 bp和187 bp），蛋白水平显著上调 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 细胞壁合成 | SMB_G3580 (murA) | UDP-N-乙酰葡糖胺1-羧乙烯基转移酶(MurA) | 催化 | 蛋白表达上调2倍，加强肽聚糖合成 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 能量供给 | SMB_G2901, SMB_G2905 | F0F1 ATP合酶亚基 | 能量供给 | 蛋白质组学显示表达差异，可能影响膜能量状态 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 转运 | SMB_G0767 | 质子依赖型寡肽转运蛋白 | 转运 | 上游156 bp处存在缺失，可能影响表达 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | DNA修复 | SMB_G0768 | DNA连接酶III | 催化 | 上游338 bp处存在缺失 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 趋化 | SMB_G1626 | 趋化感觉转导子 | 调控 | 膜蛋白表达上调2.1倍 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 翻译 | SMB_G3172 | 延伸因子Tu | 调控 | 膜相关蛋白表达上调2倍 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 蛋白折叠 | SMB_G2738 (groEL) | 伴侣蛋白GroEL | 调控 | 细胞质蛋白表达上调1.7倍 |
| Clostridium acetobutylicum DSM 1731 / Rh8 | 脂肪酸合成 | SMB_G3614 | 3-氧代酰基-(酰基载体蛋白)合酶II | 催化 | 膜蛋白表达上调1.7倍 |
关键发现
- C. acetobutylicum Rh8可耐受19 g/L丁醇，比亲本DSM 1731高46%。基因组比较发现67个单核苷酸变异（SNVs）、2个插入位点和4个缺失位点
- 其中29个SNVs位于编码序列影响21个蛋白，22个SNVs位于12个rRNA基因（覆盖8个rRNA操纵子），16个位于启动子和基因间隔区。蛋白质组数据显示差异表达蛋白的对应基因均无突变。Rchange分析表明rRNA突变可改变核糖体RNA的热力学特性（如SMB_r026中38位C→A突变导致熵变2.26，内能变7.73，自由能变5.46）。结论：菌株Rh8的丁醇耐受性可能通过调节翻译过程实现。
研究结论
比较基因组和蛋白质组分析揭示了C. acetobutylicum Rh8丁醇耐受性的新机制：通过rRNA基因突变和翻译过程调控来改变基因表达强度，从而适应丁醇胁迫。rRNA突变及翻译相关因子可作为提高微生物胁迫耐受性的新改造靶点。