高级醇 · 代谢工程文献库

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Efficient synthesis of trans-polyisoprene compounds using two thermostable enzymes in an organic-aqueous dual-liquid phase system

作者
Shinsuke Fujiwara, Aiko Yamanaka, Yosuke Yamada, Kazutake Hirooka, Hiroki Higashibata, Wakao Fukuda, Jun-ichi Nakayama, Tadayuki Imanaka, Ei-ichiro Fukusaki
单位
Department of Bioscience, Nanobiotechnology Research Center, School of Science and Technology, Kwansei Gakuin University, 2-1 Gakuen, Sanda 669-1337, Japan; Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University, Suita, Japan; Department of Synthetic Chemistry and Biological Chemistry, Graduate School of Engineering, Kyoto University, Kyoto, Japan; Laboratory for Chromatin Dynamics, Center for Developmental Biology, RIKEN, Kobe, Japan
杂志
Biochemical and Biophysical Research Communications（2007）
DOI
10.1016/j.bbrc.2007.10.133
所属领域
代谢工程
关键词
ArchaeaDual-phase reaction systemIsopentenyl diphosphate isomeraseThermococcus kodakaraensistrans-Isoprenyl diphosphate synthase
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解决的核心问题

体外酶法合成反式多异戊二烯磷酸酯时，酶与长链产物的疏水相互作用导致缩合反应效率低下，产物链长难以延伸。

研究策略

利用超嗜热古菌Thermococcus kodakaraensis的热稳定酶（IDS、IDS-Y81S及IDI），在有机-水双液相反应系统中进行酶催化合成，使疏水产物及时转移至有机相，减轻产物抑制。

研究路线图

100%
研究问题：疏水产物抑制酶法合成，链长难以延伸
策略：热稳定酶+有机-水双液相系统
关键改造：引入IDS-Y81S突变体
关键改造：联合IDI，从IPP直接合成
结果：80%产物进入有机相，产量提升4倍
结果：IDS-Y81S生成长链产物C25–C40
结果：IDI联用后C25占66.8%，出现C50
结论：双液相系统解除产物抑制，实现长链高效合成
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核心内容

本研究针对体外酶法合成反式多异戊二烯磷酸酯时因酶与长链产物疏水相互作用导致的链延伸效率低下问题，建立了基于超嗜热古菌Thermococcus kodakaraensis热稳定酶与有机-水双液相系统相结合的催化体系。将异戊烯基二磷酸异构酶、反式异戊烯基二磷酸合酶及其突变体联合用于多异戊二烯磷酸酯的合成，使疏水产物及时转移至1-丁醇有机相，缓解产物抑制。结果显示，双液相系统中超过80%产物回收于有机相；突变体IDS-Y81S在双相系统中的产量约为单相系统的4倍，C25成为主要产物（占40.7%），并检测到C30至C40等更长链产物；进一步联合IDI后产量再提高4倍以上，C25占66.8%，并出现C50等更长链产物。酶在65°C含1-丁醇条件下可保持天然构象至少1000秒以上。该策略表明热稳定酶与双液相系统协同作用可有效解除疏水产物对链延伸的抑制，为体外酶法合成更长链类异戊二烯化合物提供了可行途径。

创新点

首次将热稳定酶与有机-水双液相系统结合用于多异戊二烯磷酸酯的酶法合成；引入IDS-Y81S突变体显著提高产量和长链产物比例；通过联合IDI实现直接从IPP合成多异戊二烯磷酸酯。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) 类异戊二烯生物合成途径 Tk-idi 异戊烯基二磷酸异构酶（IDI） 催化 来自Thermococcus kodakaraensis，催化IPP与DMAPP相互转化，热稳定性极高（Tm=88.0°C），用于与IDS联用提供底物。
Escherichia coli BL21(DE3) 类异戊二烯生物合成途径 Tk-idsA 反式异戊烯基二磷酸合酶（IDS） 催化 来自Thermococcus kodakaraensis，催化IPP与烯丙基二磷酸连续缩合，最适pH 8.0，Tm=91.0°C，在双液相系统中保持活性，主要产物为FPP（C15）和GGPP（C20）。
Escherichia coli BL21(DE3) 类异戊二烯生物合成途径 Tk-idsA-Y81S 反式异戊烯基二磷酸合酶突变体（IDS-Y81S） 催化 将Tyr81替换为Ser，消除链长位阻，可生成C25以上长链产物；在双液相系统中产量提高约4倍，长链产物比例显著增加。

关键发现

  1. 在双液相系统中，超过80%的产物回收于有机相
  2. IDS-Y81S在双相系统中的产量约为单相系统的4倍，且长链产物（C25、C30等）比例增加
  3. IDI与IDS-Y81S联合使用时，多异戊二烯产量提高4倍以上，约80%产物进入1-丁醇有机相
  4. IDS在65°C含1-丁醇条件下可保持天然构象至少1000秒，IDS-Y81S至少1500秒
  5. 野生型IDS在单相系统中主要生成C15（36.7%）和C20（53.9%），双相系统中C15和C20分别占37.8%和31.6%
  6. IDS-Y81S在双相系统中C25为主要产物（40.7%），并检测到C30（10.6%）、C35（1.2%）、C40（0.3%）
  7. IDI/IDS-Y81S双相系统中C25占66.8%，并出现C40（0.8%）、C45（0.6%）、C50（0.3%）等更长链产物。

研究结论

有机-水双液相系统能有效缓解疏水相互作用对链延伸的抑制，热稳定酶在该体系中保持活性并高效合成多异戊二烯磷酸酯，突变体IDS-Y81S进一步提高了产量和链长，联合IDI可实现从IPP直接生物合成。