NGS Transcriptomes and Enzyme Inhibitors Unravel Complexity of Picrosides Biosynthesis in Picrorhiza kurroa Royle ex. Benth
- 作者
- Kirti Shitiz, Neha Sharma, Tarun Pal, Hemant Sood, Rajinder S. Chauhan
- 单位
- Department of Biotechnology and Bioinformatics, Jaypee University, Waknaghat- 73234, Solan, Himachal Pradesh, India
- 杂志
- PLoS ONE（2015）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0144546
- 所属领域
- 植物次生代谢 / 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析药用植物胡黄连中胡黄连苦苷（Picroside-I和Picroside-II）生物合成途径的复杂性，确定提供环烯醚萜骨架GPP的主要前体途径（MEP或MVA），并识别调控合成的关键基因，为代谢工程改造提供靶点。
研究策略
利用NGS转录组数据挖掘完整生物合成途径的基因并选择合适旁系同源基因；通过酶抑制剂（fosmidomycin、mevinolin、glyphosate、AOA、actinomycin D）处理结合P-I含量测定，判断各途径贡献；通过不同组织及高/低含量品系的qRT-PCR表达分析，筛选与picrosides积累相关的关键基因。
核心内容
该研究结合NGS转录组、酶抑制剂处理和qRT-PCR表达分析，系统解析了药用植物胡黄连中胡黄连苦苷（P-I和P-II）的生物合成途径。通过转录组数据挖掘，分别描绘了P-I和P-II各含41步和35步酶促反应的完整合成路径，并鉴定了环烯醚萜分支中此前未知的候选酶促步骤。抑制剂实验表明，MEP途径抑制剂fosmidomycin在15天和30天分别抑制P-I积累85.3%和90.6%，而MVA途径抑制剂mevinolin仅抑制17%和11.6%，证明MEP途径是提供环烯醚萜骨架GPP的主要来源；glyphosate和AOA的高抑制率（最高92.9%和64.6%）则说明莽草酸/苯丙烷途径同样不可或缺。跨组织及高、低P-I含量品系间的表达分析将候选基因从20个缩减为7个关键基因（ISPD、DXPS、ISPE、PMK、2HFD、EPSPS、SK），其中EPSPS和SK在品系间表达差异分别达20.28倍和57.59倍。这些结果明确了picrosides合成的前体供应逻辑，并为胡黄连分子育种提供了直接的代谢工程靶点。
创新点
首次在胡黄连中描绘了picrosides生物合成的完整酶促步骤（P-I 41步、P-II 35步）；鉴定了环烯醚萜分支中此前未知的酶促步骤候选基因；通过抑制剂实验证明MEP途径是GPP骨架的主要贡献者；结合跨组织与品系间表达分析筛选出7个关键基因。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Picrorhiza kurroa | MEP途径 | DXPS | 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase | 催化 | MEP途径第一个限速酶，抑制剂fosmidomycin靶标DXPR的上游基因；高P-I品系中表达量14.25倍于低含量品系 |
| Picrorhiza kurroa | MEP途径 | ISPD | 2-C-methylerythritol 4-phosphate cytidyl transferase | 催化 | MEP途径关键酶，高/低品系间表达差异16.86倍 |
| Picrorhiza kurroa | MEP途径 | ISPE | 4-(cytidine-5'-diphospho)-2-C-methylerythritol kinase | 催化 | MEP途径酶，高/低品系间表达差异5.63倍 |
| Picrorhiza kurroa | MVA途径 | PMK | Phosphomevalonate kinase | 催化 | MVA途径关键酶，高/低品系间表达差异5.10倍；但MVA途径整体贡献较小（mevinolin抑制仅17%） |
| Picrorhiza kurroa | 环烯醚萜途径 | 2HFD | 2-hydroxyisoflavanone dehydratase | 催化 | 预测催化第10步（musaenosidic acid脱水），高/低品系间表达差异10.25倍 |
| Picrorhiza kurroa | 莽草酸/苯丙烷途径 | EPSPS | 5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase | 催化 | 莽草酸途径关键酶，glyphosate靶标；高/低品系间表达差异20.28倍 |
| Picrorhiza kurroa | 莽草酸/苯丙烷途径 | SK | Shikimate kinase | 催化 | 莽草酸途径调控节点，高/低品系间表达差异57.59倍 |
关键发现
- P-I和P-II的生物合成分别包含41步和35步酶促反应
- 抑制剂实验表明fosmidomycin（MEP途径抑制剂）在15天和30天分别抑制P-I积累85.3%和90.6%，而mevinolin（MVA途径抑制剂）仅抑制17%和11.6%，表明MEP途径是GPP的主要来源
- glyphosate抑制率87.3%（15天）和92.9%（30天），AOA抑制率64.6%和63.4%，说明苯丙烷/莽草酸途径同样重要
- 表达分析显示20个基因初始高表达，经高/低P-I含量品系比较后短缩为7个关键基因：ISPD、DXPS、ISPE、PMK、2HFD、EPSPS、SK，其在高含量品系中的表达量为低含量品系的5-57倍
- 其中EPSPS和SK在品系间差异分别为20.28倍和57.59倍，而MEP/MVA相关基因从组织间差异的57-160倍降至品系间5-17倍，提示其与picrosides合成更直接相关。
研究结论
胡黄连中picrosides的生物合成主要由MEP途径提供GPP骨架，并需要苯丙烷/莽草酸途径提供肉桂酰/香草酰基团；鉴定的7个关键基因（ISPD、DXPS、ISPE、PMK、2HFD、EPSPS、SK）是潜在的代谢工程靶点，可用于分子育种和菌株改良。