Controlled Aggregation and Increased Stability of β-Glucuronidase by Cellulose Binding Domain Fusion
- 作者
- Soo-Jin Yeom, Gui Hwan Han, Moonjung Kim, Kil Koang Kwon, Yaoyao Fu, Haseong Kim, Hyewon Lee, Dae-Hee Lee, Heungchae Jung, Seung-Goo Lee
- 单位
- Synthetic Biology & Bioengineering Research Center, KRIBB, Yuseong-gu, Daejeon, Korea; Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, Chungnam National University, Daejeon, Korea; Biosystems & Bioengineering, University of Science & Technology, Yuseong-gu, Daejeon, Korea
- 杂志
- PLoS ONE（2017）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0170398
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高β-葡萄糖醛酸酶(GusA)的稳定性，减少高通量筛选中的假阳性，改善其工业应用性能。
研究策略
将来自Cellulomonas fimi的纤维素结合域(CBD)融合到GusA的C末端，在低温低转速下表达可溶性蛋白，纯化后系统表征其聚集状态及酶学性质，并与游离GusA进行比较。
核心内容
研究者将来自纤维单胞菌（Cellulomonas fimi）的纤维素结合域（CBD）融合至β-葡萄糖醛酸酶（GusA）的C末端，并在大肠杆菌中低温低转速表达纯化，系统表征了融合蛋白的聚集状态与酶学性质。结果表明，GusA-CBD的比活力为19 U/mg，低于游离GusA（102 U/mg），但其最适温度升至65°C、最适pH移至6.0，热稳定性显著增强：在60°C下半衰期从3.6 min延长至8.3 min；在pH 4.5–8.0范围内孵育12 h仍保持100%活性，而游离GusA在pH低于5.5时活性不足40%；在0–20%甲醇中活性提升约30%，且对蛋白酶K完全耐受。天然GusA为四聚体，GusA-CBD则以单体形式存在但孵育后可形成寡聚体，说明CBD融合可诱导可控的酶聚集状态转换。这项工作证明简单融合CBD即可在牺牲部分比活力的前提下大幅提高酶的稳定性与溶剂耐受性，为工业酶改造及减少高通量筛选假阳性提供了可行策略。
创新点
首次在体外表征了家族II CBD作为融合伴侣通过诱导酶形成人工寡聚状态来增强酶稳定性；通过调控环境条件实现了酶在可溶单体、可溶寡聚体和不可溶聚集体之间的可控转换。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli C2566 | — | gusA | β-葡萄糖醛酸酶 (GusA) | 催化 | 表达宿主；游离GusA和融合蛋白均在此菌株中表达，GusA为报告酶，催化pNPGA水解。 |
| Escherichia coli MG1655 | — | gusA | GusA | 催化 | gusA基因的基因组来源，用于PCR扩增。 |
| — | — | CBD基因（来自Cellulomonas fimi exo-1,4-β-D-葡聚糖酶） | 纤维素结合域 (CBD) | 调控 | 融合于GusA C端，通过诱导酶聚集提高稳定性，使酶在不同条件下呈现可溶单体、可溶寡聚体等状态。 |
关键发现
- 纯化的GusA、GusA-CBD、CBD-GusA比活力分别为102±4.3、19±0.6、4.3±0.1 U/mg；GusA-CBD最适温度65°C，最适pH
- 0，而游离GusA为60°C和pH
- 5。GusA-CBD在45/50/55/60°C的半衰期分别为1442/51/17/8.3 min，游离GusA为901/28.5/9.8/3.6 min。GusA-CBD在pH
- 5-8.0下12 h保留100%活性，游离GusA在pH<5.5时保留<40%。在0-20%甲醇中，GusA-CBD活性比游离GusA高30%
- 5 mg/ml蛋白酶K处理1 h后，GusA-CBD保留100%活性，游离GusA完全失活。天然GusA为四聚体（290 kDa），GusA-CBD为单体（83 kDa），但孵育后可形成寡聚体。
研究结论
通过简单融合CBD，GusA的稳定性显著提高，且可控制其聚集状态，该方法为工业酶的高稳定性和高通量筛选系统提供了新的策略。