An endophytic Basidiomycete, Grammothele lineata, isolated from Corchorus olitorius, produces paclitaxel that shows cytotoxicity
- 作者
- Avizit Das, Mohammad Imtiazur Rahman, Ahlan Sabah Ferdous, Al- Amin, Mohammad Mahbubur Rahman, Nilufar Nahar, Md. Aftab Uddin, Mohammad Riazul Islam, Haseena Khan
- 单位
- 孟加拉国达卡大学生物化学与分子生物学系；孟加拉国BCSIR纤维与聚合物科学实验室；孟加拉国达卡大学化学系；孟加拉国达卡大学遗传工程与生物技术系
- 杂志
- PLoS ONE（2017）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0178612
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇（Paclitaxel/Taxol）是重要抗癌药物，但植物提取成本高、化学合成复杂、植物细胞培养产量低，急需寻找可大规模生产的替代微生物来源。
研究策略
从黄麻（Corchorus olitorius）中分离内生真菌，通过PCR筛选紫杉醇生物合成关键基因（ts、dbat、bapt）获得阳性菌株；利用形态学和ITS序列进行菌种鉴定；通过TLC、HPLC、LC-ESI-MS/MS和FTIR鉴定并定量紫杉醇；通过HeLa细胞实验和抗菌实验评估其生物活性。
核心内容
从黄麻（Corchorus olitorius）中分离的25株内生真菌经PCR筛选，SDL-CO-2015-1菌株的ts和dbat紫杉醇生物合成关键基因为阳性。通过形态学与ITS序列鉴定，该菌与担子菌Grammothele lineata同源性达99%。利用TLC、HPLC、LC-ESI-MS/MS及FTIR分析，确认该菌产生的紫杉醇与标准品在保留时间、质谱碎片（m/z 854 [M+H]+）及特征官能团上一致，在简单PDB培养基中产量达382.2 μg/L，为首株产紫杉醇内生真菌Taxomyces andreanae报道产量的约7.6×10^3倍。HeLa细胞实验显示，0.005 μM真菌紫杉醇与标准品均诱导35%细胞死亡，显著高于10% DMSO对照的12.64%；胞内提取物对烟曲霉、菜豆壳球孢、金黄色葡萄球菌及伯克霍尔德氏菌也表现出抑制活性。这是首次发现担子菌门真菌能产紫杉醇，该菌株在简单培养条件下即可高效合成紫杉醇且具有细胞毒性和抗菌潜力，为紫杉醇的微生物发酵生产及合成途径改造提供了新底盘。
创新点
1. 首次发现担子菌门（Basidiomycota）真菌Grammothele lineata具有产生紫杉醇的能力；2. 首次报道黄麻内生真菌可产紫杉醇；3. 该菌在简单PDB培养基中紫杉醇产量达382.2 μg/L，远高于首个报道的产紫杉醇内生真菌Taxomyces andreanae（约7.6×10^3倍）。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Grammothele lineata SDL-CO-2015-1 | 紫杉醇生物合成途径 | ts | taxadiene synthase（紫杉二烯合酶） | 催化 | 限速酶，催化紫杉醇生物合成第一步 |
| Grammothele lineata SDL-CO-2015-1 | 紫杉醇生物合成途径 | dbat | 10-脱乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰转移酶 | 催化 | 催化紫杉醇合成中间步骤 |
| Grammothele lineata SDL-CO-2015-1 | 紫杉醇生物合成途径 | bapt | C-13苯丙烷侧链-CoA酰基转移酶 | 催化 | 筛选时未检测到阳性，但作为途径中的关键酶被研究 |
关键发现
- 从黄麻中分离的25株内生真菌中，SDL-CO-2015-1经PCR检测为ts和dbat基因阳性
- ITS序列与Grammothele lineata有99%同一性（query coverage 97%）
- TLC分析显示真菌紫杉醇与标准品Rf值均为0.56
- HPLC显示真菌紫杉醇保留时间约31.3 min
- LC-ESI-MS/MS显示m/z 854 [M+H]+峰，MRM碎片峰m/z 286、367、395、464、509、545、551、568、587与标准品一致
- FTIR显示羟基、酰胺、酯、酮等特征峰
- 在PDB培养基中紫杉醇产量为382.2 μg/L（是Taxomyces andreanae的7.6×10^3倍）
- 在HeLa细胞实验中，0.005 μM真菌紫杉醇和标准紫杉醇均诱导35%细胞死亡，而10% DMSO对照为12.64%
- 胞内提取物对Aspergillus fumigatus和Macrophomina phaseolina有抑制活性（200 μg时抑菌圈分别达18.5 mm和24.5 mm），对Staphylococcus aureus和Burkholderia sp也有抑制作用（200 μg时分别达26.5 mm和30.5 mm）。
研究结论
Grammothele lineata是首个被发现能产生紫杉醇的担子菌，在简单培养基中即可高效产紫杉醇，且其紫杉醇具有显著细胞毒性，真菌提取物还兼具抗菌和抗真菌活性，是紫杉醇生产及基因工程改良的优良候选菌株。