Engineering Yarrowia lipolytica for Campesterol Overproduction
- 作者
- Hao-Xing Du, Wen-Hai Xiao, Ying Wang, Xiao Zhou, Yu Zhang, Duo Liu, Ying-Jin Yuan
- 单位
- Key Laboratory of Systems Bioengineering (Ministry of Education), Tianjin University, Tianjin, China; SynBio Research Platform, Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin), School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin, China
- 杂志
- PLoS ONE（2016）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0146773
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
如何在解脂耶氏酵母中高效生产菜油固醇（campesterol），通过阻断内源麦角固醇合成途径并引入异源7-脱氢胆固醇还原酶（DHCR7），同时优化碳源与发酵策略以提高产量。
研究策略
敲除ERG5基因阻断麦角固醇合成，异源表达不同物种来源的DHCR7（来自褐家鼠、水稻、非洲爪蟾），利用蛋白质建模和分子对接筛选最优酶；比较葡萄糖、甘油和葵花籽油作为碳源的效果；采用碳源限制的高细胞密度补料分批发酵。
核心内容
该研究通过代谢工程改造解脂耶氏酵母以实现菜油固醇的过量生产。研究者敲除了内源麦角固醇合成途径中的ERG5基因以阻断竞争通路，并异源表达了来自褐家鼠、水稻和非洲爪蟾的7-脱氢胆固醇还原酶（DHCR7），结合蛋白质建模与分子对接筛选最优酶。研究发现非洲爪蟾来源的DHCR7效果最佳，结构分析揭示D409残基对底物结合具有关键作用。在碳源优化中，以葵花籽油替代葡萄糖可显著提升产量，在5-L生物反应器中采用碳源限制的高细胞密度补料分批发酵，最终菜油固醇产量达到453±24.7 mg/L，为当时已知最高微生物产量，而以葡萄糖为碳源时仅为224±25.9 mg/L。葵花籽油条件下生物量转化率为39.9%，产物得率较摇瓶水平提高328%。该工作首次在解脂耶氏酵母中实现菜油固醇的高产，证明了葵花籽油作为碳源的巨大潜力，为微生物合成复杂甾醇类化合物提供了可行的代谢工程策略参考。
创新点
首次在解脂耶氏酵母中实现菜油固醇的过量生产；确定非洲爪蟾来源DHCR7为最优酶，并通过结构建模发现D409残基对底物结合的关键作用；发现葵花籽油作为碳源显著提升产量，最终达到当时已知最高微生物产量453 mg/L。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica ATCC 201249 | 麦角固醇合成通路 | ERG5 | C-22脱饱和酶 | 催化 | 内源基因，被敲除（中间部分替换为DHCR7表达盒）以阻断麦角固醇合成，使代谢流转向菜油固醇。 |
| Yarrowia lipolytica ATCC 201249 | 菜油固醇合成通路 | DHCR7（来自非洲爪蟾Xenopus laevis） | 7-脱氢胆固醇还原酶 | 催化 | 异源表达，经密码子优化，在菌株SyBE_Y11070028中表达，催化麦角甾-5,7-二烯醇转化为菜油固醇，产量最高。 |
| Yarrowia lipolytica ATCC 201249 | 菜油固醇合成通路 | DHCR7（来自水稻Oryza saliva） | 7-脱氢胆固醇还原酶 | 催化 | 异源表达，菌株SyBE_Y11070029，因D409E突变导致活性低于非洲爪蟾来源。 |
| Yarrowia lipolytica ATCC 201249 | 菜油固醇合成通路 | DHCR7（来自褐家鼠Rattus norvegicus） | 7-脱氢胆固醇还原酶 | 催化 | 异源表达，菌株SyBE_Y11070030，活性最低，可能因L404F、S450A等位点差异。 |
关键发现
- 在5-L生物反应器中，以葵花籽油为唯一碳源、碳源限制策略下获得最高菜油固醇产量453±24.7 mg/L，为当时已知最高微生物产量
- 以葡萄糖为碳源时获得224±25.9 mg/L
- 摇瓶水平非洲爪蟾DHCR7菌株（SyBE_Y11070028）产量最高达106±8.5 mg/L
- D409E突变导致产量降低86.7%
- 葵花籽油条件下生物量转化率为39.9%，产物得率0.765%，相比摇瓶分别提高69.2%和328%
- 以葵花籽油为碳源时细胞脂质含量达0.38 g/g干重。
研究结论
通过酶筛选与碳源优化，在解脂耶氏酵母中实现了菜油固醇的高产，表明葵花籽油是极具潜力的碳源，该研究为通过代谢工程和合成生物学在微生物中生产复杂目标分子提供了重要参考。