Biosynthesis of the oxygenated diterpene nezukol in the medicinal plant Isodon rubescens is catalyzed by a pair of diterpene synthases
- 作者
- Kyle A. Pelot, Lynne M. Hagelthorn, J. Bennett Addison, Philipp Zerbe
- 单位
- Department of Plant Biology, University of California- Davis, Davis, California, United States of America; Department of Chemistry, University of California- Davis, Davis, California, United States of America
- 杂志
- PLoS ONE（2017）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0176507
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
解析药用植物碎米桠(Isodon rubescens)中二萜合酶的功能，揭示含氧二萜nezukol的生物合成机制及其在二萜类活性天然产物代谢中的角色。
研究策略
结合转录组挖掘、系统发育分析、农杆菌介导的烟草瞬时共表达、GC-MS产物鉴定、NMR结构确证、代谢物谱分析和qRT-PCR表达分析，对四个二萜合酶进行了功能表征。
核心内容
本研究从药用植物碎米桠中克隆并功能表征了四个二萜合酶基因，通过烟草瞬时共表达结合GC-MS和NMR分析，解析了含氧二萜nezukol的完整生物合成途径。研究发现IrTPS5和IrTPS3分别编码ent-CPP合酶和(+)-CPP合酶，IrTPS3与IrTPS4协同可合成miltiradiene；更为重要的是，IrTPS2作为I类二萜合酶，能以(+)-CPP为底物，通过碳正离子中间体在C-8位被水捕获，生成8β-羟基-isopimar-15-ene即nezukol，这一发现拓展了I类二萜合酶催化多样性的认知。在碎米桠叶片中检测到低丰度的nezukol产物，qRT-PCR显示IrTPS2与IrTPS3转录本丰度均较低，与其代谢物低丰度相吻合；而IrTPS4转录本约为IrTPS5的16分之一，IrTPS6则约为其10分之一。该工作首次在碎米桠中鉴定到nezukol，并揭示了一类能直接催化羟基化反应的I类二萜合酶，为代谢工程利用此类酶催化合成多样化活性二萜化合物提供了新的催化剂选择。
创新点
首次发现IrTPS2这类I类二萜合酶能够通过水捕获在C-8位引入羟基生成nezukol，拓展了I类二萜合酶催化多样性的认识；在Isodon rubescens中首次鉴定到nezukol；阐明了IrTPS3/IrTPS4合成miltiradiene的途径。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | IrTPS2 | nezukol synthase | 催化 | I类二萜合酶，催化(+)-CPP通过水捕获生成nezukol |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | IrTPS3 | (+)-CPP synthase | 催化 | II类二萜合酶，催化GGPP环化生成(+)-CPP |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | IrTPS4 | miltiradiene synthase | 催化 | I类二萜合酶，与IrTPS3共同作用生成miltiradiene |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | IrTPS5 | ent-CPP synthase | 催化 | II类二萜合酶，生成ent-CPP，可能参与oridonin生物合成 |
| Escherichia coli | 二萜生物合成 | IrTPS2 | nezukol synthase | 催化 | 用于NMR产物制备的工程化E. coli系统 |
| Isodon rubescens | 二萜生物合成 | IrTPS1 | ent-CPP synthase (predicted) | 催化 | 仅转录本预测和系统发育分析，未获得全长cDNA进行功能验证 |
| Isodon rubescens | 二萜生物合成 | IrTPS6 | ent-kaurene synthase (predicted) | 催化 | 仅转录本预测和系统发育分析，未获得全长cDNA进行功能验证 |
| Isodon rubescens | 二萜生物合成 | IrTPS7 | CPP/LPP synthase (putative) | 催化 | 仅转录本预测，系统发育与LPP合酶相关，未获得全长cDNA |
关键发现
- IrTPS5和IrTPS3分别鉴定为ent-CPP合酶和(+)-CPP合酶
- IrTPS4与IrTPS3协同生成miltiradiene
- IrTPS2与IrTPS3协同生成nezukol（8β-羟基-isopimar-15-ene），并经NMR确证。在I. rubescens叶片中检测到低丰度nezukol和微量manyol oxide。qRT-PCR显示IrTPS5转录本丰度最高，IrTPS4约为其16倍低，IrTPS6约为10倍低。IrTPS2和IrTPS3转录本丰度低，与nezukol低丰度一致。IrTPS2催化机理为(+)-CPP电离形成pimar-15-en-8-yl+碳正离子，C-8位水捕获生成nezukol。
研究结论
本研究揭示了碎米桠中一对二萜合酶（IrTPS3和IrTPS2）催化合成含氧二萜nezukol，以及IrTPS3/IrTPS4合成miltiradiene的途径；IrTPS2代表的I类二萜合酶羟化活性为代谢工程生产多样化活性二萜提供了新催化剂。