Isolation of chromosomal mutations that affect carotenoid production in Escherichia coli: mutations alter copy number of ColE1-type plasmids

作者: Luan Tao, Raymond E. Jackson, Pierre E. Rouvière, Qiong Cheng
单位: Biological and Chemical Sciences and Engineering, Central Research and Development, E.I. DuPont de Nemours Inc., Wilmington, DE 19880-0328, USA
杂志: FEMS Microbiology Letters（2004）
DOI: 10.1016/j.femsle.2004.12.015
所属领域: 代谢工程
关键词: Carotenoid biosynthesisPlasmid copy numberTransposon mutagenesis
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解决的核心问题

在大肠杆菌中分离影响类胡萝卜素产量的染色体突变，并阐明突变是否通过改变ColE1型质粒拷贝数发挥作用。

研究策略

采用转座子诱变结合颜色筛选，分离影响β-胡萝卜素产量的突变菌株；通过单引物PCR定位插入位点；利用实时PCR定量质粒拷贝数；并用其他质粒验证突变对ColE1型质粒的特异性。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究通过转座子诱变结合颜色筛选，在大肠杆菌MG1655中分离影响β-胡萝卜素产量的染色体突变株，并利用单引物PCR定位插入位点、实时PCR定量质粒拷贝数，以阐明突变对ColE1型质粒复制的影响。结果显示，深黄色突变株（Y1、Y8、Y12、Y15、Y17）的β-胡萝卜素产量为亲本的2至3倍，质粒拷贝数增加2至4倍，其中Y16拷贝数增加达10倍；浅黄色突变株W5和W6产量仅为亲本的20%至40%，白色突变株W3、W4、W16产量低于5%。W4因pcnB基因插入导致拷贝数降低超过10倍，荧光素酶报告实验证实其活性降至23%，而Y15中活性增加7.9倍。突变株W4和Y15对pACYC184和pBR328拷贝数的影响一致，但对pSC101等非ColE1型质粒无显著影响。这些结果证明染色体突变可通过特异性调控ColE1型质粒拷贝数来微调外源基因表达和代谢物产量，为代谢工程提供了一套无需重新克隆即可调节表达强度的宿主菌株工具。

创新点

发现多个染色体基因突变可改变ColE1型质粒拷贝数，提供了一套无需重新克隆即可微调基因表达和代谢物产量的宿主菌株系统。

研究对象（17）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli MG1655	类胡萝卜素生物合成	crtE	牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶	催化	来自Pantoea stewartii，催化GGPP合成
Escherichia coli MG1655	类胡萝卜素生物合成	crtB	八氢番茄红素合酶	催化	催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素
Escherichia coli MG1655	类胡萝卜素生物合成	crtI	八氢番茄红素脱饱和酶	催化	催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素
Escherichia coli MG1655	类胡萝卜素生物合成	crtY	番茄红素β-环化酶	催化	催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素
Escherichia coli MG1655	类胡萝卜素生物合成	crtX	类胡萝卜素糖基转移酶	催化	催化β-胡萝卜素之后的糖基化反应，非β-胡萝卜素合成必需
Escherichia coli MG1655	质粒复制调控	pcnB	聚腺苷酸聚合酶	调控	参与RNA I降解，突变导致ColE1型质粒拷贝数下降，W4减少超过10倍
Escherichia coli MG1655	转录调控	rpoC	RNA聚合酶β'亚基	调控	Y12突变导致质粒拷贝数增加2-4倍
Escherichia coli MG1655	cAMP信号通路	cya	腺苷酸环化酶	调控	W3突变导致类胡萝卜素产量降低，外源cAMP可恢复
Escherichia coli MG1655	三羧酸循环	mdh	苹果酸脱氢酶	催化	W5突变导致类胡萝卜素产量降低，影响前体平衡
Escherichia coli MG1655	三羧酸循环	gltA	柠檬酸合酶	催化	W6突变导致类胡萝卜素产量降低，影响前体平衡
Escherichia coli MG1655	翻译调控	thrS	苏氨酰-tRNA合成酶	调控	Y1突变导致质粒拷贝数增加2-4倍
Escherichia coli MG1655	翻译调控	rpsA	30S核糖体蛋白S1	调控	Y8突变导致质粒拷贝数增加2-4倍
Escherichia coli MG1655	RNA代谢	deaD	ATP依赖性RNA解旋酶	调控	Y4突变影响类胡萝卜素产量，但不改变质粒拷贝数
Escherichia coli MG1655	RNA代谢	orn	寡核糖核酸酶	调控	Y15突变导致质粒拷贝数增加2-4倍，荧光素酶活性增加7.9倍
Escherichia coli MG1655	转录调控	rhoL	Rho操纵子前导肽	调控	Y17突变导致质粒拷贝数增加2-4倍
Escherichia coli MG1655	铁硫簇组装	hscB	热休克同源蛋白HscB	调控	Y21突变影响类胡萝卜素产量，但不改变质粒拷贝数
Escherichia coli MG1655	细胞形态	mreC	杆状决定蛋白MreC	区室化	Y16突变导致细胞近似球形且增大，质粒拷贝数增加10倍

关键发现

深黄色突变株（Y1、Y8、Y12、Y15、Y17）β-胡萝卜素产量为亲本的2-3倍，质粒拷贝数增加2-4倍
Y16质粒拷贝数增加10倍（实时PCR）。浅黄色突变株W5和W6产量为亲本的20-40%，白色突变株W3、W4、W16产量低于5%。W4（pcnB插入）质粒拷贝数降低超过10倍。荧光素酶报告实验显示，W4中荧光素酶活性降低至23%，Y15中增加7.9倍。突变株W4和Y15对pACYC184和pBR328拷贝数的影响具有一致性，而对非ColE1型质粒（pSC101、pBHR1、pMMB66、pTJS75）无显著影响。

研究结论

分离到的大肠杆菌染色体突变可通过影响ColE1型质粒拷贝数来调控外源基因表达和代谢物产量，且该调控对ColE1型质粒具有特异性，为代谢工程提供了一套可调表达的宿主工具。