Molecular cloning and characterization of drimenol synthase from Valerian plant (Valeriana officinalis)
- 作者
- Moonhyuk Kwon, Stephen A. Cochrane, John C. Vederas, Dae-Kyun Ro
- 单位
- 卡尔加里大学生物科学系；首尔国立大学农业生物技术系及农业科学研究所；阿尔伯塔大学化学系
- 杂志
- FEBS Letters（2014）
- DOI
- 10.1016/j.febslet.2014.10.031
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
drimenol合酶基因此前未被鉴定，作者从缬草根转录组中克隆并鉴定了编码(-)-drimenol合酶的基因VoTPS3，并研究其催化机理。
研究策略
通过缬草根的454和Illumina转录组测序获得候选倍半萜合酶cDNA，在酵母和大肠杆菌中异源表达，纯化重组酶，结合NMR结构解析、酶动力学、重水标记和定点突变等手段表征功能与机理。
核心内容
研究者从缬草根转录组中克隆到一个新的倍半萜合酶基因VoTPS3，其编码556个氨基酸、分子量64.8 kDa的蛋白。将该基因在酵母EPY300中异源表达后，工程菌株能够合成drimenol，GC-MS谱图与标准品匹配度达98%；经1 L放大培养纯化出6 mg产物（纯度>95%），NMR确证其结构为(-)-drimenol，具有SSS绝对构型。重组酶的动力学参数Km为9.6±2.7 μM，kcat为0.025 s⁻¹。重水标记实验发现，在含19% H₂¹⁸O的培养体系中，有20.3%的产物掺入了¹⁸O，表明水中的氧原子直接参与环化反应。序列分析显示VoTPS3与已知缬草倍半萜合酶VoTPS1、VoTPS2的一致性分别仅41%和39%，其转录表达极低，仅为VoTPS1的2.4%。该酶可能同时利用质子化引发和电离引发两种催化机制，这在倍半萜合酶中较为罕见。VoTPS3的功能鉴定为在微生物中从头合成具有生物活性的drimane型倍半萜类化合物提供了关键前体合成模块。
创新点
['首次报道drimenol合酶基因的克隆与功能鉴定', '证明VoTPS3合成(-)-drimenol并确定其SSS绝对构型', '发现该酶可能同时利用质子化引发和电离引发两种萜类合酶机制，这在倍半萜合酶中罕见']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Valeriana officinalis | 萜类生物合成 | VoTPS3 | Drimenol synthase (VoDMS) | 催化 | 从根转录组中克隆得到 |
| Saccharomyces cerevisiae (EPY300) | 甲羟戊酸途径/倍半萜合成 | VoTPS3 | VoDMS | 催化 | 工程酵母高表达FPP，用于drimenol从头合成 |
| Escherichia coli (Rosetta pLysS) | 重组蛋白表达 | VoTPS3 (9xHis-tagged) | VoDMS | 催化 | 用于体外酶活测定和动力学分析 |
| Escherichia coli | 萜类合成 | VoTPS3 (D307A) | 突变型VoDMS | 催化 | DDxxD基序第一Asp突变为Ala，用于机理研究 |
关键发现
- 从缬草根转录组中鉴定出VoTPS3 cDNA，编码556个氨基酸（Mw 64.8 kDa）
- VoTPS3与VoTPS1、VoTPS2的序列一致性分别为41%和39%，其转录水平仅为VoTPS1的2.4%（read count 575 vs 24137）
- 在酵母EPY300中表达VoTPS3可合成drimenol，GC-MS谱匹配度98%
- 放大培养至1 L纯化获得6 mg drimenol（纯度>95%），NMR鉴定为(-)-drimenol（SSS构型）
- 重组VoTPS3的Km为9.6±2.7 μM，kcat为0.025±0.004 s^-1
- 重水标记实验中，19% H2^18O条件下检测到20.3%的m/z 224产物，证明水中的氧原子被掺入drimenol。
研究结论
VoTPS3编码(-)-drimenol合酶，可在酵母中实现drimenol的从头合成，为制备多种有生物活性的drimane型倍半萜提供前体。该酶可能采用罕见的class I和class II双机制催化FPP环化。