The γ-actin encoding gene from the β-carotene producer Blakeslea trispora
- 作者
- Marta Rodríguez-Sáiz, Ana Teresa Marcos, Begoña Paz, Juan Luis de la Fuente, José Luis Barredo
- 单位
- R&D Biology, Antibióticos S.A., Avenida de Antibióticos 59-61, 24009 León, Spain
- 杂志
- FEMS Microbiology Letters（2005）
- DOI
- 10.1016/j.femsle.2005.01.047
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并表征 β-胡萝卜素生产菌 Blakeslea trispora 的 γ-肌动蛋白编码基因 actA，并验证其启动子 PactA 可否驱动异源基因表达，为该菌缺乏转化系统时的遗传操作提供启动子工具。
研究策略
构建 B. trispora 基因组文库，用构巢曲霉 γ-肌动蛋白基因片段为探针筛选 actA 基因；通过测序和生物信息学分析基因结构、启动子元件及系统发育；通过 Northern 杂交比较 actA 与 β-胡萝卜素合成基因 carB/carRA 的表达水平；构建 PactA 驱动 bleR 和 aphI 抗性标记的融合载体，分别转化大肠杆菌和 Acremonium chrysogenum 验证启动子活性。
核心内容
研究从β-胡萝卜素生产菌三孢布拉霉中克隆并表征了γ-肌动蛋白编码基因actA及其启动子。通过基因组文库筛选获得4599 bp片段，actA开放阅读框长1561 bp，被四个内含子打断，编码375个氨基酸蛋白，预测分子量41.76 kDa，与真菌γ-肌动蛋白一致性高达97%。启动子区含TATA box、CCAAT box等典型元件。在β-胡萝卜素生产发酵条件下，actA转录本约1.4 kb，以其为参照，carRA相对表达量为0.7-0.8，carB为1.1-1.4。将PactA驱动bleR和aphI抗性标记的融合载体分别转化异源宿主，bleR使顶头孢霉获得3 μg/ml博来霉素抗性，aphI使大肠杆菌获得50 μg/ml卡那霉素抗性，证明该启动子具备驱动异源基因表达的功能。这为缺乏稳定转化系统的三孢布拉霉及其它真菌的遗传操作提供了可用的启动子工具，也为理解该菌β-胡萝卜素合成相关基因的转录调控奠定了基础。
创新点
首次报道 B. trispora 的 γ-肌动蛋白基因及其 5' 调控区；通过异源表达证明 PactA 能驱动两个抗性标记基因（bleR 和 aphI）在细菌和真菌中表达，是潜在的真菌表达启动子。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Blakeslea trispora | β-胡萝卜素生物合成 | carB | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 参与β-胡萝卜素合成，在发酵条件下转录水平约为actA的1.1-1.4倍 |
| Blakeslea trispora | β-胡萝卜素生物合成 | carRA | 双功能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 参与β-胡萝卜素合成，转录水平约为actA的0.7-0.8倍 |
| Blakeslea trispora | 细胞骨架（初级代谢） | actA | γ-肌动蛋白 | 调控 | 编码组成型表达的γ-肌动蛋白，本研究克隆其启动子PactA用于异源表达；其本身为结构蛋白 |
| Escherichia coli | 异源表达（抗性标记） | aphI | 氨基糖苷3'-磷酸转移酶 | 催化 | 在PactA控制下表达，使大肠杆菌具有50 μg/ml卡那霉素抗性 |
| Acremonium chrysogenum | 异源表达（抗性标记） | bleR | 博来霉素结合蛋白 | 催化 | 在PactA控制下表达，使顶头孢霉具有3 μg/ml博来霉素抗性 |
关键发现
- 获得的 4599 bp 基因组片段含 actA 基因，开放阅读框 1561 bp，被四个内含子（128、146、93、69 bp）打断，编码 375 个氨基酸的蛋白，预测分子量
- 76 kDa，等电点
- 39；与真菌 γ-肌动蛋白氨基酸一致性高（与 Absidia blakeesleana 97%），并具有标准的 γ-肌动蛋白 N 端特征序列。启动子区含有 TATA box、CCAAT box、富嘧啶区及 poly(A) 信号。在 β-胡萝卜素生产发酵条件下，actA 转录本约
- 4 kb，carB 约
- 8 kb，carRA 约
- 9 kb；以 actA 为参照，carRA 相对表达量为
- 7-0.8，carB 为
- 1-1.4。PactA 驱动 bleR 在顶头孢霉中赋予 3 μg/ml 博来霉素抗性；驱动 aphI 在大肠杆菌中赋予 50 μg/ml 卡那霉素抗性。
研究结论
B. trispora actA 基因被克隆和表征，其启动子经异源表达证实具有驱动基因表达的功能，可作为今后 B. trispora 或其他真菌遗传操作中的候选表达启动子。