Development of transgenic Brassica juncea lines for reduced seed sinapine content by perturbing phenylpropanoid pathway genes
- 作者
- Sachin Kajla, Arundhati Mukhopadhyay, Akshay K. Pradhan
- 单位
- 印度德里大学南校区遗传学系；印度德里大学南校区作物植物遗传操作中心
- 杂志
- PLoS ONE（2017）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0182747
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
芸苔属种子中芥子碱（sinapine）是主要抗营养化合物，会导致动物产品异味，限制蛋白质丰富的种子粕利用。芥子碱含量在现有种质中过高（6.7-15.1 mg/g DSW），缺乏低含量自然变异，传统育种难以降低，需通过转基因手段下调其合成基因。
研究策略
采用农杆菌介导转化，通过反义RNA、RNAi和人工microRNA三种RNA沉默方法分别构建针对SGT和SCT基因（芥子碱合成最后两步关键酶）的共8个沉默载体，转化B. juncea cv. Varuna，筛选低芥子碱纯合系。
核心内容
针对油菜籽粕中芥子碱含量过高导致的抗营养问题，该研究在芥菜型油菜品种Varuna中系统比较了反义RNA、RNAi和人工microRNA三种RNA沉默策略对芥子碱合成最后两步关键酶基因SGT和SCT的抑制效果。通过农杆菌介导转化构建了8个沉默载体，获得1232个独立T0转基因事件，并在T2代筛选出25个单基因纯合系。结果显示，种子芥子碱含量降低幅度为15.8%至67.2%，最优品系BjSGTamiR40.35.1的含量降至3.79 mg/g DSW，较原始种质的6.7-15.1 mg/g DSW显著下降。效率比较表明RNAi策略最为有效，43.4%的RNAi系达到至少30%的降低比例，而反义RNA和amiRNA分别仅为10.4%和11.2%；同时靶向SGT基因比靶向SCT更为有效。qRT-PCR证实SGT和SCT的转录水平分别降低了1.3-2.6倍和1.2-6.3倍。该工作建立了可用的低芥子碱纯合种质，为后续通过育种或叠加不同基因抑制效应进一步优化油籽粕品质提供了重要材料基础。
创新点
首次在B. juncea中系统比较三种RNA沉默方法（反义RNA、RNAi、amiRNA）对SGT/SCT基因的抑制效率；证明RNAi更高效；获得芥子碱含量降低高达67.2%的纯合转基因品系，并建立可用的低芥子碱种质。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Brassica juncea cv. Varuna | 芥子碱生物合成途径（苯丙烷代谢途径） | SGT | UDP-葡萄糖:芥子酸葡萄糖基转移酶 (UDP-glucose:sinapate glucosyltransferase) | 催化 | 催化芥子酸生成1-O-芥子酰葡萄糖 |
| Brassica juncea cv. Varuna | 芥子碱生物合成途径（苯丙烷代谢途径） | SCT | 芥子酰葡萄糖:胆碱芥子酰转移酶 (sinapoylglucose:choline sinapoyltransferase) | 催化 | 催化1-O-芥子酰葡萄糖与胆碱生成芥子碱 |
| Brassica juncea cv. Varuna | — | bar | 草铵膦乙酰转移酶 (phosphinothricin acetyltransferase) | 催化 | 作为除草剂抗性筛选标记 |
关键发现
B. juncea种质芥子碱含量为6.7-15.1 mg/g DSW，远高于允许的3.0 mg/g DSW。通过8个沉默载体共获得1232个独立T0转基因事件，在T2代筛选出25个单基因纯合系，种子芥子碱含量降低15.8%-67.2%，其中最优系BjSGTamiR40.35.1含量为3.79 mg/g DSW（降低67.2%）。RNAi方法的效率最高，43.4%的RNAi系达到≥30%降低，而反义RNA和amiRNA分别为10.4%和11.2%。靶向SGT比靶向SCT更有效（23.1% vs 6.1%）。qRT-PCR显示SGT转录水平降低1.3-2.6倍，SCT转录水平降低1.2-6.3倍。
研究结论
通过RNA沉默SGT和SCT基因，可有效降低B. juncea种子中芥子碱含量，获得低芥子碱纯合品系，为改善油籽粕品质提供材料；这些品系可进一步用于育种或通过杂交叠加不同基因的抑制效应进一步降低芥子碱。