Enhancement of geraniol resistance of Escherichia coli by MarA overexpression
- 作者
- Asad Ali Shah, Chonglong Wang, Young-Ryun Chung, Jae-Yean Kim, Eui-Sung Choi, Seon-Won Kim
- 单位
- Division of Applied Life Science (Brain Korea 21 Program), Plant Molecular Biology and Biotechnology Research Center, Gyeongsang National University, 900 Gajwadong, Jinju 660-701, Republic of Korea; Industrial Biotechnology Research Center, Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 125 Gwahak-ro, Yuseong-gu, Daejeon 305-806, Republic of Korea
- 杂志
- Journal of Bioscience and Bioengineering（2012）
- DOI
- 10.1016/j.jbiosc.2012.10.009
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高大肠杆菌对萜类生物燃料前体香叶醇的耐受性，以支持萜类生物燃料的微生物生产。
研究策略
在大肠杆菌中分别过表达已知与有机溶剂耐受相关的基因 marA、imp、cls 和 cti，通过平板覆盖和液体覆盖培养评估对异戊烯醇、香叶醇、月桂烯和金合欢醇的耐受性，并利用单基因敲除突变体研究 MarA 通过 AcrAB-TolC 外排泵增强香叶醇耐受的机制。
核心内容
该研究通过在Escherichia coli中分别过表达与有机溶剂耐受相关的基因marA、imp、cls和cti，系统评估了其对异戊烯醇、香叶醇、月桂烯和金合欢醇的耐受性影响。结果显示，过表达转录调控因子MarA能显著增强大肠杆菌对香叶醇的耐受性，使菌株在1%（v/v）香叶醇平板覆盖下的菌落形成效率较野生型提高10⁴倍；液体培养4小时后仍保持4.2×10⁵个/mL活细胞，而对照已无存活。胞内香叶醇积累测定表明，MarA过表达菌株的胞内香叶醇浓度降至6.3 μg/mg WCW，约为对照（12.9 μg/mg WCW）的一半，而ΔmarA和ΔtolC突变体则分别升至18.4和16.3 μg/mg WCW。通过单基因敲除实验证实，acrA、acrB和tolC缺失均导致菌株对香叶醇超敏感，且marA过表达无法恢复这些突变体的耐受性，表明该作用依赖AcrAB-TolC外排泵。imp过表达反而增加溶剂敏感性，cls和cti则无改善效果。该研究揭示MarA过表达通过激活AcrAB-TolC外排泵将香叶醇泵出细胞、降低胞内浓度来提升耐受性，为利用调控因子而非直接过表达外排泵组分提高萜类生物燃料的微生物生产提供了更简单有效的策略。
创新点
发现过表达转录调控因子 MarA 而非直接过表达外排泵组分，能够显著增强大肠杆菌对香叶醇的耐受性，并证明该作用依赖于 AcrAB-TolC 外排泵，且相比直接过表达外排泵组分，过表达调控因子 MarA 是更简单有效的策略。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | Mar/Sox 调控子 | marA | MarA | 调控 | 转录激活因子，过表达增强大肠杆菌对香叶醇的耐受性，激活 AcrAB-TolC 外排泵 |
| Escherichia coli | AcrAB-TolC 外排泵 | acrA | AcrA | 转运 | 外排泵膜融合蛋白，缺失导致香叶醇超敏感 |
| Escherichia coli | AcrAB-TolC 外排泵 | acrB | AcrB | 转运 | 外排泵内膜转运蛋白，缺失导致香叶醇超敏感 |
| Escherichia coli | AcrAB-TolC 外排泵 | tolC | TolC | 转运 | 外排泵外膜通道蛋白，缺失导致香叶醇超敏感 |
| Escherichia coli | 细胞被膜生物发生 | imp | Imp (OstA) | 区室化 | 参与外膜被膜生物发生，维持膜通透性屏障，过表达未提高耐受性反而导致敏感 |
| Escherichia coli | 心磷脂合成 | cls | Cls | 催化 | 心磷脂合酶，催化心磷脂合成，过表达未提高萜类耐受性 |
| Escherichia coli | 脂肪酸顺反异构化 | cti | Cti | 催化 | 来自 Pseudomonas putida 的顺反异构酶，过表达未提高萜类耐受性 |
关键发现
- 过表达 marA 使大肠杆菌在 1% (v/v) 香叶醇平板覆盖下的菌落形成效率较野生型对照提高 10^4 倍；在液体覆盖培养中，4 小时后 marA 过表达菌株仍保持
- 2×10^5 个/mL 活细胞，而空载体对照已无活细胞。细胞内香叶醇积累测定显示，marA 过表达菌株的胞内香叶醇浓度为
- 3 μg/mg WCW，比对照（12.9 μg/mg WCW）降低约 2 倍；ΔmarA 和 ΔtolC 突变体则分别升高至
- 4 和
- 3 μg/mg WCW。imp 过表达导致细胞对测试溶剂更敏感，cls 和 cti 过表达无耐受性改善。acrA、acrB 和 tolC 单基因敲除均使 E. coli 对香叶醇超敏感，且 marA 过表达无法恢复这些突变体的耐受性。
研究结论
MarA 过表达通过激活 AcrAB-TolC 外排泵将香叶醇泵出细胞，降低胞内香叶醇浓度，从而显著提高大肠杆菌的香叶醇耐受性，该策略有望用于提高萜类生物燃料的微生物生产。