Cloning and sequencing of a gene encoding of aldehyde oxidase in Pseudomonas sp. AIU 362
- 作者
- Yasutaka Sasaki, Nobuyuki Urano, Michihiko Kataoka, Jun Ogawa, Akira Iwasaki, Junzo Hasegawa, Kimiyasu Isobe, Sakayu Shimizu
- 单位
- The United Graduate School of Agricultural Sciences, Iwate University; Division of Applied Life Sciences, Graduate School of Agriculture, Kyoto University; Division of Applied Life Sciences, Graduate School of Life and Environmental Sciences, Osaka Prefecture University; Life Science R&D Center, Kaneka Co.; Faculty of Bioenvironmental Science, Kyoto Gakuen University
- 杂志
- Journal of Bioscience and Bioengineering（2012）
- DOI
- 10.1016/j.jbiosc.2012.02.018
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并测序来自Pseudomonas sp. AIU 362的一种能够氧化乙二醛但不氧化乙醛酸的醛氧化酶(ALOD)基因，并阐明其酶学特性及其与3-羟基异丁酸脱氢酶(3-HIBDH)的关系。
研究策略
基于ALOD的N端氨基酸序列与3-HIBDH高度同源的特点，设计PCR引物从Pseudomonas sp. AIU 362基因组中扩增ALOD基因；通过Southern杂交和colony hybridization获取阳性克隆并测序；构建pET-21a(+)表达载体转化E. coli BL21进行异源表达；纯化重组酶并对其底物特异性、动力学参数与3-HIBDH进行比较。
核心内容
本研究从Pseudomonas sp. AIU 362中克隆并测序了编码醛氧化酶（ALOD）的基因。该基因含888个核苷酸的开放阅读框，编码295个氨基酸，其推导序列与P. putida E23及KT2440的3-羟基异丁酸脱氢酶（3-HIBDH）一致性约95%。将基因构建至pET-21a(+)载体并在E. coli BL21中异源表达后，重组ALOD表达量达3.6 U/mL培养液，较原始菌株提高20,000倍。纯化后的重组酶乙二醛氧化比活为14.5 U/mg蛋白，但以NAD+为辅因子时对L-3-羟基异丁酸的脱氢活性最高达948 U/mg，其乙二醛氧化速率仅为脱氢活性的1.5%。P. putida KT2440的3-HIBDH同样表现出乙二醛氧化活性且底物谱与ALOD相似。结果表明ALOD与3-HIBDH属于同一酶群，其主要催化功能是L-3-羟基异丁酸脱氢，醛氧化为辅反应，为理解该酶家族的底物歧化机制提供了依据。
创新点
首次克隆了Pseudomonas sp. AIU 362的ALOD基因，发现其与3-羟基异丁酸脱氢酶(3-HIBDH)氨基酸序列一致性约95%，且重组ALOD同时具有ALOD和3-HIBDH双重催化活性；证明ALOD与3-HIBDH属于同一酶群；通过异源表达使ALOD产量提高20,000倍。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas sp. AIU 362 | 乙二醛氧化/醛氧化代谢 | ALOD | 醛氧化酶 (ALOD) | 催化 | 原始菌株，ALOD基因来源；该酶氧化乙二醛但不氧化乙醛酸 |
| Escherichia coli BL21 | 异源表达 | ALOD | 重组醛氧化酶 (ALOD) | 催化 | 表达宿主，含有pET-21a(+)-ALOD质粒；重组ALOD产量达3.6 U/mL，比原始菌高20,000倍 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 3-羟基异丁酸脱氢代谢 | 3-HIBDH | 3-羟基异丁酸脱氢酶 (3-HIBDH) | 催化 | 该酶也表现出ALOD活性，能氧化乙二醛等醛类，乙二醛氧化活性为L-3-羟基异丁酸脱氢活性的1.2% |
| Escherichia coli JM109 | 克隆/异源表达 | 3-HIBDH (来自P. putida KT2440) | 重组3-羟基异丁酸脱氢酶 (3-HIBDH) | 催化 | 用于克隆筛选和表达重组3-HIBDH |
关键发现
- ALOD基因包含888个核苷酸的开放阅读框，编码295个氨基酸，登录号AB436915
- 推导氨基酸序列与P. putida E23和KT2440的3-HIBDH一致性约95%
- 重组ALOD在E. coli BL21中表达量达3.6 U/mL培养液，比Pseudomonas sp. AIU 362原始菌株高20,000倍
- 纯化重组ALOD的乙二醛氧化比活为14.5 U/mg蛋白
- 以NAD+为辅因子时，对L-3-羟基异丁酸的脱氢酶活性最高为948 U/mg，Km值分别为L-3-羟基异丁酸0.24 mM、NAD+ 0.10 mM
- 乙二醛氧化速率仅为L-3-羟基异丁酸脱氢速率的1.5%
- P. putida KT2440的3-HIBDH也表现出乙二醛氧化活性，其乙二醛氧化速率为L-3-羟基异丁酸脱氢活性的1.2%，且底物谱与ALOD相似。
研究结论
Pseudomonas sp. AIU 362的ALOD与P. putida E23和KT2440的3-HIBDH具有高度序列同源性，且均具有醛氧化和3-羟基异丁酸脱氢双重催化活性，应归类为同一酶群；ALOD的主要催化反应可能是L-3-羟基异丁酸的脱氢，而醛氧化为辅反应。