Isolation and characterization of a mutant recombinant Saccharomyces cerevisiae strain with high efficiency xylose utilization
- 作者
- Masataka Tomitaka, Hisataka Taguchi, Kohsai Fukuda, Takashi Akamatsu, Kenji Kida
- 单位
- Department of Applied Microbial Technology, Faculty of Biotechnology and Life Science, Sojo University, 4-22-1 Ikeda, Kumamoto 860-0082, Japan; Graduate School of Science and Technology, Kumamoto University, 2-39-1 Kurokami, Chuo-ku, Kumamoto 860-0862, Japan
- 杂志
- Journal of Bioscience and Bioengineering（2013）
- DOI
- 10.1016/j.jbiosc.2013.05.027
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
工业酿酒酵母无法高效利用木糖发酵产乙醇，重组菌株的木糖利用率和乙醇产量仍较低。
研究策略
以耐热耐酸的工业酿酒酵母NAM34-4C为底盘，通过染色体整合Pichia stipitis的XYL1和XYL2以及内源XKS1基因，构建重组菌株SCB7；在木糖为唯一碳源的培养基中自发突变筛选快速生长突变体，并通过遗传分析、分批发酵等手段评估突变体的木糖利用和乙醇生产效率。
核心内容
该研究以耐热耐酸的工业酿酒酵母NAM34-4C为底盘，通过染色体单拷贝整合树干毕赤酵母木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2以及内源木酮糖激酶基因XKS1，构建了重组菌株SCB7，使其能在以木糖为唯一碳源的培养基中生长，最短代时5小时。随后通过自发突变筛选，获得了四个木糖利用效率显著提升的Hex⁺突变体（SCB13–16），其最短代时缩短至2.5小时。在含30 g/L木糖、pH 4.0、35°C的分批发酵中，突变体HEX1-2在24小时内产乙醇4.8 g/L，乙醇收率47%，为亲本菌株SCB7（3.4 g/L）的1.4倍，木糖消耗速率平均达1 g/L/h。遗传分析表明四个突变分属三个连锁群，其中hex3-5为PHO13基因的隐性突变，HEX2-2与HEX2-9紧密连锁，HEX2-3独立，且所有突变均与TAL1不连锁。该研究不仅获得了木糖利用和乙醇产量大幅提升的工业菌株，还鉴定了PHO13作为关键负调控因子，并揭示了两个未知的显性突变位点，为酿酒酵母木糖发酵性能的进一步工程改造提供了重要靶点。
创新点
1) 在工业菌株中构建单拷贝整合木糖代谢基因的重组菌株，获得最短代时5h的木糖同化能力；2) 自发突变获得最短代时2.5h的Hex+突变体；3) 遗传分析证明一个隐性突变位于PHO13基因，其余为显性突变，且与TAL1不连锁；4) 突变体24h内产乙醇4.8g/L，收率47%，为亲本的1.4倍。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae SCB7 | 木糖代谢 | XYL1 | 木糖还原酶 | 催化 | 来自Pichia stipitis，整合于染色体，受TDH3启动子控制 |
| Saccharomyces cerevisiae SCB7 | 木糖代谢 | XYL2 | 木糖醇脱氢酶 | 催化 | 来自Pichia stipitis，整合于染色体，受TDH3启动子控制 |
| Saccharomyces cerevisiae SCB7 | 木糖代谢 | XKS1 | 木酮糖激酶 | 催化 | 内源基因，整合于染色体，受TDH3启动子控制 |
| Saccharomyces cerevisiae SCB7 | 戊糖磷酸途径 | TAL1 | 转醛醇酶 | 催化 | 过表达可改善木糖同化，但与Hex突变不连锁 |
| Saccharomyces cerevisiae SCB7 | 木糖代谢调控 | PHO13 | 对硝基苯基磷酸酶 | 调控 | 隐性突变hex3-5位于该基因，缺失或突变提高木糖利用 |
| Saccharomyces cerevisiae SCB7 | 木糖转运 | HXT5, HXT7 | 己糖转运蛋白Hxt5, Hxt7 | 转运 | 木糖为唯一碳源时表达的转运蛋白，参与木糖摄取 |
关键发现
- 构建的重组菌株SCB7在含20g/L木糖的MSX培养基中最短代时为5h
- 在此基础上分离的四个Hex+突变体（SCB13-16）最短代时缩短至2.5h。四个突变体在含30g/L木糖的YPX培养基（pH4.0，35°C）中分批发酵，其中HEX1-2突变体在24h内产乙醇4.8g/L，乙醇收率47%，比亲本SCB7的3.4g/L高1.4倍
- 四个突变体的木糖消耗速率均呈线性下降，平均为1g/L/h。遗传分析表明四个突变分别属于三个连锁群，其中hex3-5为PHO13基因的隐性突变，而HEX2-2和HEX2-9紧密连锁，HEX2-3独立，所有突变均与TAL1基因不连锁。
研究结论
本研究成功从工业酿酒酵母中构建出高效利用木糖的重组菌株，并通过自发突变获得显著提高木糖消耗速率和乙醇产量的Hex+突变体。遗传分析鉴定了PHO13基因作为关键调控因子，同时发现两个未知的显性突变位点，这些发现为酿酒酵母木糖发酵性能的进一步工程改造提供了重要基础和靶点。