Establishment of an Arabidopsis callus system to study the interrelations of biosynthesis, degradation and accumulation of carotenoids
- 作者
- Patrick Schaub, Marta Rodriguez-Franco, Christopher Ian Cazzonelli, Daniel Álvarez, Florian Wüst, Ralf Welsch
- 单位
- University of Freiburg, Faculty of Biology, Institute for Biology II, Freiburg, Germany; Hawkesbury Institute for the Environment, University of Western Sydney, Hawkesbury Campus, Richmond, NSW Australia
- 杂志
- PLoS ONE（2018）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0192158
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
非绿色组织中类胡萝卜素（特别是β-胡萝卜素）的稳态积累受合成与降解共同调控，需要建立模型系统来量化这些关系。
研究策略
利用拟南芥非绿色愈伤组织系统，结合PSY过表达株系、类胡萝卜素突变体、NFZ酶抑制和代谢物分析，量化类胡萝卜素合成通量与降解速率，并鉴定降解产物。
核心内容
本研究以拟南芥种子来源的非绿色愈伤组织为模型，系统探究了类胡萝卜素合成、降解与积累之间的动态平衡关系。通过结合PSY过表达株系、ccd1/ccd4突变体、NFZ酶抑制处理及代谢物分析等手段，研究者量化了合成通量与降解速率，并鉴定了降解产物。结果显示，叶片中类胡萝卜素含量约2300 μg/g干重，经4周暗培养诱导愈伤后仅残留约1%（40.8 μg/g），表明降解极为剧烈；而ccd1、ccd4及其双突变体愈伤中类胡萝卜素残留量可达20%，显著高于野生型的11%，提示酶促裂解并非主要降解途径。进一步实验发现，添加抗氧化剂trolox可使类胡萝卜素含量提升约50%，非酶促氧化被确认为类胡萝卜素损失的主导因素。通过ZmPSY1过表达株系的代谢通量估算，每天合成约180 nmol八氢番茄红素，其中仅约50 nmol净转化为β-胡萝卜素，约130 nmol被降解，说明高PSY活性足以超越降解速率以实现积累。此外，还鉴定出包括β-脱辅基类胡萝卜素醛、β-紫罗酮及乙二醛/甲基乙二醛在内的多种氧化产物。该研究揭示了非酶促氧化在类胡萝卜素稳态中的核心作用，并证明通过增强合成通量可有效突破降解瓶颈，为利用非绿色组织进行类胡萝卜素代谢工程提供了理论依据和模型平台。
创新点
建立了种子来源的拟南芥愈伤组织类胡萝卜素分析体系；发现非酶促氧化降解是类胡萝卜素损失的主要途径；揭示不同类胡萝卜素对降解的敏感性差异；鉴定出β-胡萝卜素氧化产物包括β-脱辅基类胡萝卜素醛和乙二醛/甲基乙二醛；证明β-胡萝卜素在质体内形成晶体。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana）愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成 | PSY | 八氢番茄红素合成酶（Phytoene synthase） | 催化 | 类胡萝卜素生物合成的第一个限速酶，过表达可提高通量，强表达可使β-胡萝卜素积累至500 μg/g DM。 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana）愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成 | PDS | 八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase） | 催化 | 催化八氢番茄红素脱氢，可被NFZ抑制；pds突变体积累八氢番茄红素。 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana）愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成 | ZDS | ζ-胡萝卜素脱氢酶（Zeta-carotene desaturase） | 催化 | 催化ζ-胡萝卜素脱氢生成pro-番茄红素。 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana）愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成 | CRTISO | 类胡萝卜素异构酶（Carotenoid isomerase） | 催化 | 催化顺式类胡萝卜素异构化为全反式；crtISO突变体在暗中积累顺式中间产物。 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana）愈伤组织 | 类胡萝卜素降解 | CCD1 | 类胡萝卜素裂解双加氧酶1（Carotenoid cleavage dioxygenase 1） | 催化 | 参与类胡萝卜素氧化裂解，ccd1突变体愈伤组织类胡萝卜素残留约20%。 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana）愈伤组织 | 类胡萝卜素降解 | CCD4 | 类胡萝卜素裂解双加氧酶4（Carotenoid cleavage dioxygenase 4） | 催化 | 参与类胡萝卜素降解，ccd4突变体愈伤组织类胡萝卜素残留约20%。 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana）愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成 | CrtI | 细菌八氢番茄红素脱氢酶（bacterial phytoene desaturase CrtI） | 催化 | 来自泛菌的脱氢酶/异构酶，可绕过PDS抑制，在NFZ存在下仍能合成类胡萝卜素。 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana）愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成 | GGPPS | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（Geranylgeranyl diphosphate synthase） | 催化 | 用于体外PSY活性测定，提供底物GGPP。 |
关键发现
['WT叶片类胡萝卜素约2300 μg/g DM，4周暗培养愈伤组织后残留约1%（40.8 μg/g DM）。', 'ccd1、ccd4及双突变体愈伤组织类胡萝卜素残留约20%，WT约11%。', '添加trolox（维生素E类似物）使类胡萝卜素约300 μg/g，比对照高约50%。', 'crtISO突变体愈伤组织总类胡萝卜素约为WT两倍，其中积累约250 μg/g的脱氢中间产物（含pro-番茄红素、八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素）。', 'PSY过表达强株系（At12、At22）β-胡萝卜素可积累至500 μg/g DM。', '弱过表达株系（At13、AtU16）类胡萝卜素水平与WT相似，但NFZ处理下八氢番茄红素积累约1500 μg/g，强株系约1900 μg/g。', '体外PSY活性：弱株系比WT高约75%，强株系高约300%。', 'ZmPSY1株系每天合成约180 nmol（100 μg/g）八氢番茄红素，β-胡萝卜素净增约50 nmol（27 μg/g）每天，约130 nmol（70 μg/g）被降解。', "鉴定到β-脱辅基类胡萝卜素醛（包括retinal、β-apo-14'-carotenal、β-apo-12'-carotenal、β-apo-10'-carotenal、β-apo-8'-carotenal、β-apo-13-carotenone等）、β-紫罗酮、β-环柠檬醛、5,6-环氧-β-紫罗酮、脱辅基胡萝卜素二醛（C5-C10）以及乙二醛和甲基乙二醛。"]
研究结论
非酶促氧化是愈伤组织类胡萝卜素降解的主因，不同胡萝卜素稳定性差异大；足够高的PSY活性可超过降解速率从而积累β-胡萝卜素；氧化产物可能为类胡萝卜素碳回收提供途径。