A systematic comparison of triterpenoid biosynthetic enzymes for the production of oleanolic acid in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Matthew P. Dale, Tessa Moses, Emily J. Johnston, Susan J. Rosser
- 单位
- School of Biological Sciences, University of Edinburgh, Edinburgh, Scotland, United Kingdom
- 杂志
- PLoS ONE（2020）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0231980
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
缺乏对β-香树脂醇合酶和CYP716A酶在酵母中生产齐墩果酸的系统性比较，导致难以选择最优酶变体
研究策略
在酿酒酵母中系统比较12个β-香树脂醇合酶和16个CYP716A同源酶的产量和产物谱，并组合最优酶以验证效果
核心内容
该研究在酿酒酵母中系统比较了12个β-香树脂醇合酶和16个CYP716A细胞色素P450酶的组合表现，以优化齐墩果酸的微生物合成路径。通过逐一表达每种酶并测定产物产量及分布，发现不同BAS变体的β-香树脂醇产量相差3.7倍，其中AaBAS和CqBAS1产量最高，达到10.8±1.0 mg/L，而SlBAS最低。在CYP716A家族中，齐墩果酸产量相差4.8倍，CYP716AL1表现最佳（14.3±1.6 mg/L），而CYP716A75则主要积累中间产物erythrodiol。将最优组合AaBAS与CYP716AL1联用获得8.5±0.2 mg/L齐墩果酸，显著优于最差组合。研究还新表征了来自棉花、橄榄和可可的三种活性酶。结果表明，酶变体的选择对三萜产量具有决定性影响，不同CYP716A的产物特异性可用于定向合成不同修饰程度的三萜产物，为工业相关三萜的酵母生产提供了有价值的选择依据。
创新点
首次系统比较BAS和CYP716A酶在酵母中的活性；新表征了来自棉花（GhBAS）、橄榄（CYP716A48）和可可（CYP716A147）的酶；揭示了不同CYP716A酶的产物分布差异
研究对象（29）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | AsBAS | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 来自Avena strigosa，未检测到β-香树脂醇产量 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | BvBAS | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 来自Barbarea vulgaris，可能同时产生lupeol |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | AaBAS | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 来自Artemisia annua，产量最高之一 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CqBAS1 | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 产量最高之一 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | EtBAS | β-香树脂醇合酶 | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | LjBAS | β-香树脂醇合酶 | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | PtBAS | β-香树脂醇合酶 | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | SlBAS | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 产量最低 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | GhBAS | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 新表征，来自Gossypium hirsutum |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | GgBAS | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 来自Glycyrrhiza glabra，常用对照 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | MtBAS | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 来自Medicago truncatula，常用对照 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | PgBAS1 | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 来自Panax ginseng |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A1 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A12 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | 来自Medicago truncatula，常用对照 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A15 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A44 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A48 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | 新表征，来自Olea europaea |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A52v2 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | 齐墩果酸产量最低 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A75 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | 主要产生erythrodiol |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A79 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A80 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A83 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A110 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A140 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | 本研究中未检测到活性 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A147 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | 新表征，来自Theobroma cacao |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A179 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716A244 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | CYP716AL1 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP716A亚家族） | 催化 | 齐墩果酸产量最高 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 三萜生物合成通路（从2,3-氧化角鲨烯到齐墩果酸） | ATR2 | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 来自Arabidopsis thaliana，P450的氧化还原伴侣 |
关键发现
在12种BAS中，β-香树脂醇产量和生产力分别相差3.7倍和6.3倍，其中AaBAS和CqBAS1产量最高（10.8±1.0 mg/L），SlBAS最低（2.9±0.3 mg/L）。在16种CYP716A中，齐墩果酸产量和生产力分别相差4.8倍和4.5倍，CYP716AL1产量最高（14.3±1.6 mg/L），CYP716A52v2最低（3.0±0.0 mg/L）。CYP716A75主要产生erythrodiol（24.6±3.9 mg/L），而CYP716AL1和CYP716A12更偏向齐墩果酸生产。将最佳BAS（AaBAS）与最佳CYP716A（CYP716AL1）组合获得8.5±0.2 mg/L齐墩果酸，而使用最差BAS（SlBAS）则为3.9±0.2 mg/L。新表征的GhBAS、CYP716A48和CYP716A147具有活性。此外，BvBAS还能产生lupeol等其他三萜。
研究结论
系统比较表明，酶变体的选择对三萜产量有显著影响，AaBAS/CqBAS1和CYP716AL1是生产齐墩果酸的最佳组合，同时不同CYP716A的产物特异性可用于生产不同修饰的三萜，为工业相关三萜的酵母生产提供了资源。