An L213A variant of β-glycosidase from Sulfolobus solfataricus with increased α-L-arabinofuranosidase activity converts ginsenoside Rc to compound K
- 作者
- Ji-Hyeon Choi, Kyung-Chul Shin, Deok-Kun Oh
- 单位
- Department of Bioscience and Biotechnology, Konkuk University, Seoul, Republic of Korea
- 杂志
- PLoS ONE（2018）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0191018
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型β-糖苷酶对人参皂苷Rc上α-L-阿拉伯呋喃糖苷键的水解活性低或缺失，导致无法高效将Rc转化为Compound K。
研究策略
通过同源建模、分子对接和与具有α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的Pyrococcus furiosus β-糖苷酶进行序列比对，锁定候选残基，再经定点突变筛选出L213A突变体，并对该突变体的底物特异性、结合能、转化途径及产物生成进行表征。
核心内容
针对野生型β-糖苷酶对人参皂苷Rc上α-L-阿拉伯呋喃糖苷键水解活性低的问题，研究者通过同源建模、分子对接及与Pyrococcus furiosus β-糖苷酶的序列比对，锁定候选残基并实施定点突变，获得L213A突变体。该突变体显著增强了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性，并建立了Rc→Rd→F2→Compound K的新转化途径。在10小时内，突变体将4 mM人参皂苷Rc转化为3.8 mM Compound K，摩尔转化率达97%，产量为野生型的1.5倍；以C-Mc为底物时，14小时内转化率同样达97%，产量为野生型的2倍。突变体对C-Mc的比活力提高2.2倍，结合能由-86.5 kcal/mol降至-177.2 kcal/mol，且对F2、Rb1也有更高的比活力。结果表明蛋白质工程能有效增强特定糖苷水解活性，为人参皂苷高效生物转化提供了可行策略。
创新点
1. 通过蛋白质工程获得L213A突变体，显著增强了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性；2. 建立了Rc→Rd→F2→C-K的新转化途径；3. 突变体从Rc和C-Mc生产C-K的摩尔转化率均达97%，较野生型分别提高1.5倍和2倍。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 人参皂苷生物转化（PPD型人参皂苷降解） | β-糖苷酶基因（Sulfolobus solfataricus，包含L213A突变） | β-糖苷酶（L213A突变体） | 催化 | 异源表达，用于生产Compound K |
| Sulfolobus solfataricus | 人参皂苷Rc代谢 | β-糖苷酶基因（野生型） | β-糖苷酶（野生型） | 催化 | 天然酶，具有β-D-葡萄糖苷酶等活性，但α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性低 |
| Pyrococcus furiosus | 人参皂苷Rc转化 | β-糖苷酶基因 | β-糖苷酶（P. furiosus） | 催化 | 用于序列比对，具有α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性 |
关键发现
- L213A突变体在10 h内将4 mM人参皂苷Rc转化为3.8 mM C-K（摩尔转化率97%），野生型仅产生2.5 mM（62%），产量提高1.5倍
- 从C-Mc出发，突变体在14 h内将4 mM C-Mc转化为3.8 mM C-K（97%），野生型为1.9 mM（47%），产量提高2倍
- 突变体对C-Mc的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶比活力为146 nmol/min/mg，野生型为66.1 nmol/min/mg，提高2.2倍
- 突变体与C-Mc的结合能由野生型的-86.5 kcal/mol降至-177.2 kcal/mol（更稳定）。此外，突变体对F2、Rb1的比活力分别达33400和13650 nmol/min/mg，高于野生型。
研究结论
通过定点突变获得的L213A突变体增强了β-糖苷酶对人参皂苷中α-L-阿拉伯呋喃糖苷键的水解活性，使人参皂苷Rc和C-Mc能以97%的摩尔转化率高效转化为Compound K，证明蛋白质工程是增强特定糖苷水解活性的有效策略。