Improvement of organic solvent tolerance by disruption of the lon gene in Escherichia coli
- 作者
- Rei Watanabe, Noriyuki Doukyu
- 单位
- Graduate School of Interdisciplinary New Science, Toyo University, 2100 Kujirai, Kawagoe, Saitama 350-8585, Japan; Bio-Nano Electronic Research Center, Toyo University, 2100 Kujirai, Kawagoe, Saitama 350-8585, Japan; Department of Life Science, Toyo University, 1-1-1 Izumino, Itakura-machi, Gunma 374-0193, Japan
- 杂志
- Journal of Bioscience and Bioengineering（2014）
- DOI
- 10.1016/j.jbiosc.2014.01.011
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌对有机溶剂的耐受性有限，如何通过基因改造提高其有机溶剂耐受性，并阐明其分子机制。
研究策略
以E. coli K-12为底盘，敲除lon基因及其相关基因（wcaJ、acrB），构建单基因和双基因敲除突变株，通过平板菌落形成效率、液体培养生长、免疫印迹和抗生素敏感性实验，分析lon基因缺失对有机溶剂耐受性的影响及机制。
核心内容
该研究以大肠杆菌K-12为底盘，通过敲除lon蛋白酶基因及其相关基因（acrB、wcaJ），构建单基因和双基因敲除突变株，系统考察了有机溶剂耐受性的变化及分子机制。研究发现，敲除lon基因可显著提高大肠杆菌的有机溶剂耐受性，BW25113Δlon在正己烷存在下菌落形成效率比亲本株提高约10²倍，在正己烷/环己烷混合物中提高约10³倍。机制分析显示，lon缺失使AcrB蛋白表达水平升至亲本株的约2倍，且敲除acrB后耐受性完全丧失，而敲除wcaJ（荚膜多糖合成基因）不影响耐受性，证明该效应依赖AcrAB-TolC外排泵而非荚膜多糖。然而，在已高表达AcrAB-TolC的JA300 acrRIS marR菌株中额外敲除lon反而使AcrB表达减半并降低耐受性。此外，BW25113Δlon对氯霉素的最低抑菌浓度由6 μg/ml提高至12 μg/ml，但对新生霉素和氧氟沙星无影响。研究表明lon基因可作为调控外排泵表达以提高溶剂耐受性的改造靶点，但其效果受菌株背景限制，需谨慎应用。
创新点
首次证明敲除lon基因可显著提高大肠杆菌的有机溶剂耐受性，并揭示该效应依赖于AcrAB-TolC外排泵而非荚膜多糖；进一步发现在高耐受性菌株JA300 acrRIS marR中额外敲除lon反而降低耐受性。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 | AcrAB-TolC efflux pump | lon | Lon protease | 调控 | 敲除lon导致AcrB表达上调，提高有机溶剂耐受性 |
| Escherichia coli BW25113 | AcrAB-TolC efflux pump | acrB | AcrB | 转运 | 外排泵组分，敲除后消除lon突变体的耐受性优势 |
| Escherichia coli BW25113 | Colanic acid biosynthesis | wcaJ | WcaJ | 催化 | 催化colanic acid合成第一步，敲除后非黏液型但不影响有机溶剂耐受性 |
| Escherichia coli JA300 | AcrAB-TolC efflux pump | acrR | AcrR | 调控 | acrR突变（IS5插入）使AcrAB-TolC泵过表达，提高溶剂耐受性 |
| Escherichia coli JA300 | AcrAB-TolC efflux pump | marR | MarR | 调控 | marR109突变导致MarA表达增强，进而激活AcrAB-TolC表达 |
| Escherichia coli | Mar/Sox regulon | marA | MarA | 调控 | 转录激活因子，被Lon蛋白酶降解，lon缺失可稳定MarA |
| Escherichia coli | Sox regulon | soxS | SoxS | 调控 | 转录激活因子，被Lon蛋白酶降解 |
关键发现
- BW25113Δlon在正己烷存在下菌落形成效率比亲本株高10^2倍，在正己烷/环己烷(9:1)混合物中高10^3倍
- BW25113Δlon的AcrB蛋白表达水平约为亲本株的2倍
- BW25113ΔlonΔacrB对有机溶剂高度敏感，表明AcrAB-TolC泵是lon突变体提高耐受性的关键
- BW25113ΔlonΔwcaJ（非黏液型）与BW25113Δlon的耐受性相似，证明荚膜多糖不参与
- JA300 acrRIS marR Δlon的AcrB表达水平约为JA300 acrRIS marR的一半，且有机溶剂耐受性降低
- BW25113Δlon对氯霉素的MIC从6 μg/ml提高至12 μg/ml，对新生霉素和氧氟沙星的MIC无变化。
研究结论
敲除lon基因通过提高AcrAB-TolC外排泵的表达水平来增强大肠杆菌的有机溶剂耐受性，而荚膜多糖不参与该过程；但在已高表达AcrAB-TolC的菌株中再敲除lon会产生不利影响，降低耐受性。