Cholesterol oxidase with high catalytic activity from Pseudomonas aeruginosa: Screening, molecular genetic analysis, expression and characterization
- 作者
- Noriyuki Doukyu, Shyou Nihei
- 单位
- Bio-Nano Electronic Research Center, Toyo University, 2100, Kujirai, Kawagoe, Saitama, 350-8585, Japan; Graduate School of Life Sciences, Toyo University, 1-1-1 Izumino, Itakura-machi, Gunma, 374-0193, Japan; Department of Life Sciences, Toyo University, 1-1-1 Izumino, Itakura-machi, Gunma, 374-0193, Japan
- 杂志
- Journal of Bioscience and Bioengineering（2015）
- DOI
- 10.1016/j.jbiosc.2014.12.003
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
筛选并表征来自铜绿假单胞菌的高催化活性胆固醇氧化酶，解决该酶在异源表达中形成包涵体、难以获得可溶性活性蛋白的问题，并首次阐明其酶学性质。
研究策略
利用含胆固醇的筛选培养基从土壤中筛选产HCEO型胆固醇氧化酶的菌株；基于P. aeruginosa PAO1基因组中推定胆固醇氧化酶基因序列设计引物，从PA157菌株中克隆目的基因；构建pET表达载体，通过低温（10°C）诱导实现可溶性表达；经DEAE和CM离子交换层析纯化，系统表征酶的生化性质。
核心内容
从土壤中筛选出一株产高活性胆固醇氧化酶的铜绿假单胞菌PA157，其16S rDNA与P. aeruginosa PAO1相似性达99.3%。基于基因组中推定胆固醇氧化酶基因序列设计引物克隆目的基因，该ORF长1791 bp，编码597个氨基酸，成熟蛋白含541个氨基酸。构建pET表达载体转化大肠杆菌Rosetta (DE3) pLysS，发现在10°C低温诱导时可获得可溶性活性蛋白，活性为1.1 U/mg，远高于20°C和30°C时的0.18和0.015 U/mg。经两步离子交换层析纯化后比活达11.6 U/mg，纯化倍数11倍，收率26%。该酶最适pH 7.5，最适温度70°C，70°C保温30分钟仍保留90%活性；对胆固醇的Km为92.6 μM，Vmax为15.9 μmol/min/mg，高于多种已报道和市售胆固醇氧化酶。该酶对多种去垢剂和有机溶剂表现出良好耐受性，氧化产物为6β-氢过氧胆甾-4-烯-3-酮。这是首次对铜绿假单胞菌胆固醇氧化酶进行克隆表达与系统表征，其高催化效率和稳定性使其在临床胆固醇检测及生物转化领域具有应用潜力。
创新点
首次报道P. aeruginosa胆固醇氧化酶的克隆表达与表征；通过10°C低温培养成功获得可溶性活性重组酶；该酶Vmax值高于已报道和市售的多种胆固醇氧化酶，且具有较高的热稳定性和有机溶剂/去垢剂耐受性。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas aeruginosa PA157 | 胆固醇氧化代谢 | 胆固醇氧化酶基因（GenBank AB920752） | 胆固醇氧化酶（PA157 ChoX） | 催化 | 来源菌株，胞外产生HCEO型胆固醇氧化酶 |
| Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS | 重组蛋白表达 | 胆固醇氧化酶基因（pETpaccx质粒） | 重组胆固醇氧化酶 | 催化 | 异源表达宿主，10°C低温诱导获得可溶性活性酶 |
关键发现
- 筛选到菌株PA157，其16S rDNA与P. aeruginosa PAO1相似性为99.3%；胆固醇氧化酶基因ORF长1791 bp，编码597个氨基酸（预测分子量65,344 Da，pI
- 96），成熟蛋白含541个氨基酸（59,626 Da）；重组酶在10°C、20°C、30°C表达时的活性分别为1.1、0.18、0.015 U/mg；纯化后比活为11.6 U/mg，纯化倍数11倍，收率26%，总蛋白2.34 mg；最适pH
- 5，pH
- 0-8.0时活性>95%，pH稳定性5.5-11；最适温度70°C，70°C保温30 min保留90%活性，75°C几乎完全失活；1 mM Ag+和Cu2+分别使活性降至76%和78%
- 5% Tween
- Triton X-100、Triton X-405、sarcosyl、sodium cholate存在时活性为171%、177%、155%、154%、114%，SDS和LBS完全抑制；50%有机溶剂中氯仿、甲苯、p-二甲苯、环辛烷存在时活性为89%、112%、102%、108%，甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇存在时为65%、31%、2%、6%；对胆固醇的Km=92.6±3.0 μM，Vmax=15.9±1.0 μmol/min/mg；底物特异性：胆固醇100%、β-胆甾烷醇96%、β-谷甾醇81%、β-豆甾醇42%、孕烯醇酮47%，对表雄酮和脱氢表雄酮无活性；氧化产物为6β-氢过氧胆甾-4-烯-3-酮（HCEO），分子量417.3 (M+H)，λmax 249 nm；该酶Vmax高于Chromobacterium sp. DS-1 (10.4)、Burkholderia cepacia ST-200 (7.0)、Nocardia sp. (5.2)、Streptomyces sp. SA-COO (3.9) 和Nocardia erythropolis (3.0) 的相应酶。
研究结论
从P. aeruginosa PA157中获得的胆固醇氧化酶属于VAO家族II类酶，催化胆固醇生成HCEO。该酶具有高催化效率（Vmax显著高于已知酶）、优良的热稳定性和去垢剂/有机溶剂耐受性，在临床胆固醇检测和生物转化领域具有应用潜力。本研究是首次对P. aeruginosa胆固醇氧化酶进行克隆、表达和表征。