Change in the plasmid copy number in acetic acid Bacteria in response to growth phase and acetic acid Concentration
- 作者
- Naoki Akasaka, Wiwik Astuti, Yuri Ishii, Ryota Hidese, Hisao Sakoda, Shinsuke Fujiwara
- 单位
- Institute of Applied Microbiology, Marukan Vinegar Co. Ltd.; Department of Bioscience, Graduate School of Science and Technology, Kwansei Gakuin University; Research Center for Environmental Bioscience, Graduate School of Science and Technology, Kwansei-Gakuin University
- 杂志
- Journal of Bioscience and Bioengineering（2014）
- DOI
- 10.1016/j.jbiosc.2014.11.003
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析醋酸菌Gluconacetobacter europaeus中隐蔽质粒拷贝数随生长阶段和乙酸浓度的变化规律，并开发适用于醋酸菌的穿梭载体。
研究策略
从G. europaeus KGMA0119中分离三个隐蔽质粒（pGE1、pGE2、pGE3），进行全序列测定和ORF功能预测；利用实时定量PCR测定不同生长阶段、不同乙醇/乙酸浓度下各质粒拷贝数；将pGE2和pGE3与pBR322连接构建穿梭载体，并电转入大肠杆菌、A. pasteurianus和G. europaeus验证宿主范围。
核心内容
该研究从醋酸菌Gluconacetobacter europaeus KGMA0119中分离了三个隐蔽质粒pGE1（2.5 kb，3个ORF）、pGE2（7.2 kb，8个ORF）和pGE3（5.5 kb，4个ORF），进行全序列测定和ORF功能预测后，采用实时定量PCR测定了不同生长阶段和乙醇/乙酸浓度下的质粒拷贝数。结果显示，pGE1拷贝数受生长阶段和乙酸浓度显著影响：在含0.4%乙醇和0.5%乙酸条件下，pGE1从对数期的7 copies/genome升至稳定期初期的最大值12 copies/genome，随后降至4 copies/genome；当乙酸浓度升至1.0%时，对数期pGE1拷贝数达10 copies/genome，pGE3由约3 copies/genome升至6 copies/genome，而pGE2始终维持在1–3 copies/genome。进一步将pGE2和pGE3与pBR322连接构建了穿梭载体pBE2（11548 bp）和pBE3（9898 bp），二者均能在E. coli、A. pasteurianus及G. europaeus中复制，而pBR322和pGE1衍生物不能。上述结果表明，pGE1和pGE3可能通过提高拷贝数增强乙酸胁迫下相关基因表达，所构建的穿梭载体为醋酸菌代谢工程提供了可用的遗传操作工具。
创新点
首次报道G. europaeus隐蔽质粒拷贝数受乙酸浓度和生长阶段影响；pGE1在乙酸浓度升高时拷贝数增加；构建了基于pGE2和pGE3的、可在多种醋酸菌中复制的穿梭载体pBE2和pBE3。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Gluconacetobacter europaeus KGMA0119 | 质粒接合转移 | pGE1 ORF1-1 | Mob | 转运 | 移动蛋白，负责质粒接合转移 |
| Gluconacetobacter europaeus KGMA0119 | 质粒稳定维持 | pGE2 ORF2-3 | Kid | 催化 | 毒素蛋白（RNase），通过降解mRNA消除无质粒细胞，维持质粒稳定性 |
| Gluconacetobacter europaeus KGMA0119 | 质粒复制 | pGE2 ORF2-4 | Rep | 调控 | 复制起始蛋白，参与质粒复制和拷贝数控制 |
| Gluconacetobacter europaeus KGMA0119 | 质粒接合转移 | pGE2 ORF2-5 | Mob | 转运 | 移动蛋白，参与质粒接合转移 |
| Gluconacetobacter europaeus KGMA0119 | 质粒复制 | pGE2 ORF2-8 | Rep | 调控 | 复制起始蛋白，与Acetobacter aceti的Rep20同源（60% identity） |
| Gluconacetobacter europaeus KGMA0119 | 吩嗪生物合成 | pGE3 ORF3-2 | PhzF | 催化 | PhzF家族吩嗪生物合成蛋白，具体功能未知 |
| Gluconacetobacter europaeus KGMA0119 | 质粒复制 | pGE3 ORF3-3 | RepB | 调控 | 复制起始蛋白，与Acetobacter pomorum的Rep同源（65% identity），也与G. europaeus RepB高度同源 |
| Gluconacetobacter europaeus KGMA0119 | 质粒拷贝数调控 | pGE3 ORF3-4 | CopG | 调控 | 转录抑制子，抑制repB及自身启动子，调控质粒拷贝数 |
| Gluconacetobacter europaeus KGMA0119 | 氨基酸代谢（支链氨基酸合成） | aldC | α-乙酰乳酸脱羧酶 | 催化 | 单拷贝参考基因，用于质粒拷贝数的实时定量PCR测定 |
关键发现
- 从G. europaeus KGMA0119中分离到三个隐蔽质粒pGE1（2.5kb，3个ORF）、pGE2（7.2kb，8个ORF）和pGE3（5.5kb，4个ORF）。在含0.4%乙醇和0.5%乙酸培养基中，pGE1拷贝数从对数期7 copies/genome升至稳定期初期的最大值12 copies/genome，随后降至晚期稳定期的4 copies/genome
- pGE2和pGE3在各生长阶段维持1-3 copies/genome。在3.2%乙醇条件下，pGE1各阶段拷贝数略低，pGE2和pGE3无变化。在1.0%乙酸条件下，对数期pGE1拷贝数达10 copies/genome，pGE3达6 copies/genome（0.5%乙酸时约3），而pGE2不变。构建的穿梭载体pBE2（11548bp）和pBE3（9898bp）可在大肠杆菌、A. pasteurianus和G. europaeus中复制，而pBR322和pGE1衍生物不能在醋酸菌中复制。
研究结论
G. europaeus隐蔽质粒的拷贝数受生长阶段和乙酸浓度影响，pGE1和pGE3可能在乙酸胁迫下通过提高拷贝数增强相关基因表达；基于pGE2和pGE3构建的穿梭载体pBE2、pBE3适用于大肠杆菌和多种醋酸菌的遗传操作，为醋酸菌的代谢工程提供了工具。