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Selection and validation of reference genes desirable for gene expression analysis by qRT-PCR in MeJA-treated ginseng hairy roots

作者
Li Li, Kangyu Wang, Mingzhu Zhao, Shaokun Li, Yue Jiang, Lei Zhu, Jing Chen, Yanfang Wang, Chunyu Sun, Ping Chen, Jun Lei, Meiping Zhang, Yi Wang
单位
College of Life Science, Jilin Agricultural University; Research Center of Ginseng Genetic Resources Development and Utilization; College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University; Key Laboratory of Natural Resources of Changbai Mountain & Functional Molecules (Yanbian University), Ministry of Education
杂志
PLoS ONE（2019）
DOI
10.1371/journal.pone.0226168
所属领域
基因表达分析
关键词
人参毛状根人参皂苷生物合成内参基因实时荧光定量PCR茉莉酸甲酯
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解决的核心问题

在茉莉酸甲酯（MeJA）处理的人参毛状根中，缺乏经过验证的、适用于qRT-PCR基因表达分析的内参基因，导致基因表达定量结果不可靠。

研究策略

选取12个常用候选内参基因，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper三种软件分析其表达稳定性；并以4个人参皂苷生物合成关键酶基因（PgFPS、PgDDS、PgUGT71A27、PgCYP716A47）为靶标，通过比较不同内参基因归一化后的表达水平及其与人参皂苷含量的相关性，验证内参基因的可靠性。

研究路线图

100%
研究问题：MeJA处理人参毛状根缺乏验证内参基因
策略：选取12个候选内参基因
关键改造：geNorm/NormFinder/BestKeeper三软件分析
验证：靶基因表达与人参皂苷含量相关性
结果：CYP最稳定（0.234）；18S最不稳定（0.909）
结果：CYP归一化后靶基因与皂苷含量显著相关
结果：MeJA后F1含量0.06%→0.73%
结论：CYP为MeJA处理人参毛状根最优内参基因
研究对象：12个候选内参基因（18S,ACT1,aTUB,bTUB,CYC,CYP,EF-1α,eIF-5A,F-box,GAPDH,IF3G1,UBQ）及4个靶基因（PgFPS,PgDDS,PgUGT71A27,PgCYP716A47）
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核心内容

本研究针对茉莉酸甲酯（MeJA）处理的人参毛状根中缺乏可靠内参基因的问题，系统评估了12个常用候选内参基因的表达稳定性。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper三种算法分析，发现geNorm鉴定CYP和EF-1α最为稳定；NormFinder中CYP稳定性值0.234为最优，而18S最不稳定（0.909）；BestKeeper中所有候选基因SD值均大于1.0。进一步以4个人参皂苷生物合成关键酶基因为靶标，通过比较不同内参归一化后的表达水平与皂苷含量的相关性验证可靠性，发现以CYP为内参时，PgFPS和PgUGT71A27的表达与11种人参皂苷含量显著相关，而使用18S时相关性显著下降。MeJA处理后人参皂苷F1含量由0.599 mg/g升至7.298 mg/g，PPT型/PPD型皂苷比由1.28升至1.50。结果表明CYP是MeJA处理的人参毛状根qRT-PCR分析最合适的内参基因，为准确解析人参皂苷生物合成基因表达调控提供了关键工具。

创新点

首次针对MeJA处理的人参毛状根系统筛选和验证内参基因；创新性地将靶基因表达与人参皂苷含量的相关性分析作为内参基因验证手段；明确了CYP为最适内参基因。

研究对象（16）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Panax ginseng hairy roots 核糖体生物合成 18S rRNA — 催化 候选内参基因
Panax ginseng hairy roots 细胞骨架 ACT1 肌动蛋白 调控 候选内参基因
Panax ginseng hairy roots 细胞骨架 aTUB 微管蛋白α-1链 调控 候选内参基因
Panax ginseng hairy roots 细胞骨架 bTUB β-微管蛋白 调控 候选内参基因
Panax ginseng hairy roots 蛋白质折叠 CYC 亲环蛋白ABH类似蛋白 催化 候选内参基因
Panax ginseng hairy roots 蛋白质折叠 CYP 亲环蛋白 催化 候选内参基因，最终确定为最适内参基因
Panax ginseng hairy roots 蛋白质合成 EF-1α 延伸因子1-α 催化 候选内参基因
Panax ginseng hairy roots 蛋白质合成 eIF-5A 翻译起始因子eIF-5A 调控 候选内参基因
Panax ginseng hairy roots 泛素-蛋白酶体 F-box F-box蛋白 调控 候选内参基因
Panax ginseng hairy roots 糖酵解 GAPDH 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 催化 候选内参基因
Panax ginseng hairy roots 蛋白质合成 IF3G1 真核翻译起始因子3G1 调控 候选内参基因
Panax ginseng hairy roots 泛素化 UBQ 多聚泛素 调控 候选内参基因
Panax ginseng hairy roots 人参皂苷生物合成（甲羟戊酸途径） PgFPS 法尼基焦磷酸合酶 催化 目标基因，参与人参皂苷生物合成的关键酶
Panax ginseng hairy roots 人参皂苷生物合成（甲羟戊酸途径） PgDDS 达玛烯二醇合酶 催化 目标基因，参与人参皂苷生物合成的关键酶
Panax ginseng hairy roots 人参皂苷生物合成（甲羟戊酸途径） PgUGT71A27 UDP-糖基转移酶UGT71A27 催化 目标基因，参与人参皂苷生物合成的关键酶
Panax ginseng hairy roots 人参皂苷生物合成（甲羟戊酸途径） PgCYP716A47 细胞色素P450单加氧酶CYP716A47 催化 目标基因，参与人参皂苷生物合成的关键酶

关键发现

  1. geNorm分析中CYP和EF-1α为最稳定内参基因
  2. NormFinder分析中CYP稳定性值0.234，为最稳定，18S最不稳定（0.909）
  3. BestKeeper分析中18S的SD值最低（1.25），但所有候选基因SD均大于1.0。使用CYP作为内参时，PgFPS和PgUGT71A27的表达与11种人参皂苷含量显著相关，PgDDS和PgCYP716A47与8种显著相关
  4. 使用18S时相关性显著下降，PgCYP716A47无显著相关。MeJA处理后F1含量由0.599 mg/g（0.06%）升至7.298 mg/g（0.73%）
  5. PPT型/PPD型人参皂苷含量比由1.28升至48h时的最高值1.50。

研究结论

CYP基因是MeJA处理的人参毛状根中qRT-PCR基因表达分析最合适的内参基因，可用于研究人参皂苷生物合成相关基因的表达与调控。