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Identification of Lycopene epsilon cyclase (LCYE) gene mutants to potentially increase β-carotene content in durum wheat (Triticum turgidum L.ssp. durum) through TILLING

作者
Daniela Richaud, Claudia Stange, Agata Gadaleta, Pasqualina Colasuonno, Roberto Parada, Andrés R. Schwember
单位
Laboratorio de Fitomejoramiento Molecular, Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile; Laboratorio de Biología Molecular Vegetal, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Santiago, Chile; Department of Environmental and Territorial Sciences (DISAAT), University of Bari "Aldo Moro", Bari, Italy
杂志
PLoS ONE（2018）
DOI
10.1371/journal.pone.0208948
所属领域
代谢工程
关键词
Lycopene epsilon cyclaseTILLINGcarotenoid biosynthesisdurum wheatβ-carotene
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解决的核心问题

硬粒小麦籽粒中β-胡萝卜素含量低，营养价值有待提升；通过基因突变筛选以期增加β-胡萝卜素含量。

研究策略

利用EMS诱变的Kronos TILLING突变体群体（1,370个个体），设计LCYE-A和LCYE-B基因组特异性引物，经CEL1（CJE）酶切检测异源双链，随后测序并用SIFT、BLOSUM62和PSSM算法评估突变效应，最后对突变体叶片和籽粒进行类胡萝卜素提取与HPLC分析。

研究路线图

100%
硬粒小麦籽粒β-胡萝卜素含量低，营养价值待提升
基于EMS诱变Kronos TILLING群体（1,370个体）筛选突变位点
设计LCYE-A/B特异性引物，CEL1酶切检测异源双链
获得21个LCYE-A、18个LCYE-B候选突变体
6个关键功能错义/无义突变被SIFT/PSSM等算法预测影响蛋白功能
突变体2426（W437*）：叶片β-胡萝卜素含量提高75%
TILLING有效获得LCYE优异等位基因，W437*显著提升β-胡萝卜素含量，可用于小麦改良
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核心内容

该研究利用TILLING技术，在含1,370个个体的EMS诱变硬粒小麦Kronos突变体库中筛选番茄红素ε-环化酶（LCYE）基因的功能缺失突变，以期提高籽粒β-胡萝卜素含量。研究者设计LCYE-A和LCYE-B基因组特异性引物，经CEL1酶切检测异源双链后测序，并采用SIFT、BLOSUM62和PSSM算法评估突变效应。共从突变体库中鉴定出21个LCYE-A和18个LCYE-B候选突变，最终获得7个LCYE-A和11个LCYE-B突变，其中6个预测影响蛋白功能，包括LCYE-A的W437*无义突变、P334L和G368R，以及LCYE-B的P405L、G352R和T393I。携带W437*的突变体2426在叶片中β-胡萝卜素含量提高75%，总类胡萝卜素显著增加，但籽粒中总类胡萝卜素和叶黄素无显著差异。这一发现表明LCYE功能缺失可显著提高叶片β-胡萝卜素积累，具有改善植物环境抗性的潜力，且这些等位基因可稳定遗传，适用于传统育种和功能基因组研究。

创新点

首次在硬粒小麦中通过TILLING鉴定LCYE基因功能缺失突变体；发现W437*无义突变使叶片β-胡萝卜素含量提高75%；使用2%琼脂糖凝胶简化TILLING检测步骤。

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Triticum turgidum L. ssp. durum (硬粒小麦) 类胡萝卜素生物合成途径 LCYE-A Lycopene epsilon cyclase (LCYE) 催化 位于3A染色体，催化番茄红素ε-环化；突变W437*产生提前终止密码子，导致叶片β-胡萝卜素增加75%。
Triticum turgidum L. ssp. durum (硬粒小麦) 类胡萝卜素生物合成途径 LCYE-B Lycopene epsilon cyclase (LCYE) 催化 位于3B染色体，催化番茄红素ε-环化；突变P405L、G352R、T393I预测影响蛋白功能。

关键发现

  1. 从1,370个Kronos TILLING系中鉴定出21个LCYE-A和18个LCYE-B候选突变
  2. 测序获得7个LCYE-A和11个LCYE-B突变，其中6个（LCYE-A: W437*, P334L, G368R
  3. LCYE-B: P405L, G352R, T393I）预测影响蛋白功能
  4. 突变体2426（W437*）叶片β-胡萝卜素含量增加75%，总类胡萝卜素含量显著提高，但籽粒中总类胡萝卜素和叶黄素无显著差异
  5. LCYE-B W484S多态性（Kronos vs Chinese Spring）也可能影响蛋白功能。

研究结论

TILLING技术成功鉴定出可提高β-胡萝卜素含量的LCYE等位基因，其中W437*突变显著增加叶片β-胡萝卜素，具有改善植物环境抗性的潜力；这些等位基因可稳定遗传，适用于传统育种与功能基因组研究。