In situ recovery of lycopene during biosynthesis with recombinant Escherichia coli
- 作者
- Ko-Woon Yoon, Eun-Hee Doo, Seon-Won Kim, Jin-Byung Park
- 单位
- Department of Food Science & Technology, Ewha Womans University; Division of Applied Life Science (BK21), EB-NCRC and PMBBRC, Gyeongsang National University
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2008）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2008.04.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
番茄红素作为疏水性大分子（C40），在重组大肠杆菌生物合成过程中对细胞膜产生毒性，抑制菌体代谢和生长，导致产量受限。如何利用原位产物回收技术减轻产物毒性、提高产量是核心问题。
研究策略
构建有机/水两相系统，通过溶菌酶和EDTA处理细胞制备球形体（spheroplasts），部分消化细胞壁以促进番茄红素从细胞膜向有机相萃取，实现原位产物回收，并比较不同有机溶剂及水相组成对回收和生物合成的影响。
核心内容
针对重组大肠杆菌合成番茄红素时产物对细胞膜产生毒性、限制产量的瓶颈，本研究构建了有机/水两相系统实现原位产物回收。研究中利用溶菌酶和EDTA部分消化细胞壁制备球形体，促进番茄红素从细胞膜向有机相萃取，并系统比较了不同有机溶剂和水相组成的影响。结果显示，癸烷凭借较高logP值对球形体毒性较低，以0.25 M蔗糖缓冲液替代2YT培养基可维持球形体形态稳定，使萃取效率提升43%。在5 L生物反应器中，经溶菌酶和EDTA处理的重组菌总产量达14.1 mg/L，每克干细胞产量为3.8 mg，比未处理对照提高42%。该策略通过减轻产物膜毒性，有效提升了疏水性大分子的生物合成产量，为其他萜类等膜相关产物的原位回收提供了可行思路。
创新点
['首次将球形体（spheroplasts）制备与有机/水两相系统结合，用于原位回收大分子疏水产物番茄红素，显著促进其从细胞膜向有机相转移。', '发现癸烷/蔗糖缓冲液体系能维持球形体形态，避免细胞恢复完整，使萃取效率比2YT体系提高43%。', '通过原位回收策略，使重组大肠杆菌番茄红素总产量提高约40%（按每克干细胞计提高42%）。']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 番茄红素生物合成途径 | gps | — | 催化 | 来自Archaeoglobus fulgidus，参与类异戊二烯前体合成 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 番茄红素生物合成途径 | crtB | — | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，编码八氢番茄红素合酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 番茄红素生物合成途径 | crtI | — | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，编码八氢番茄红素脱氢酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 番茄红素生物合成途径 | idi | — | 催化 | 来自Escherichia coli，编码异戊烯基焦磷酸异构酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 番茄红素生物合成途径 | dxs | — | 催化 | 来自Escherichia coli，编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | — | Lysozyme | 催化 | 用于制备球形体，部分消化细胞壁，促进番茄红素萃取 |
关键发现
- ['在摇瓶培养中，E. coli DH5α(pT-GLYC4, pSdxs)和BL21(DE3)(pT-GLYC4, pSdxs)的番茄红素含量均为2.6-2.9 mg/g干细胞，最终浓度约11.8 mg/L
- BL21(DE3)的生产速率约为DH5α的2倍。', '在5 L生物反应器中，BL21(DE3)的番茄红素含量约2.3 mg/g干细胞，最终浓度10.2 mg/L
- 当DOT降至约60%（t=5h）后代谢活性下降，细胞生长停止时番茄红素合成也终止（t=9h）。', '单独加入辛烷或癸烷（相比为0.5）时，细胞中的番茄红素几乎不被萃取到有机相。', '用溶菌酶和EDTA处理后，番茄红素从生物质向有机相的萃取量显著增加
- 辛烷对处理后的细胞毒性较大（logP 4.5，比癸烷低25%），癸烷更适合作为萃取溶剂。', '以0.25 M蔗糖溶液代替2YT培养基作为水相时，OD600nm保持恒定，且萃取到有机相的番茄红素量增加43%。', '未处理细胞的番茄红素总产量（水相+有机相）为11.2 mg/L
- 经溶菌酶和EDTA处理后的细胞，总产量达14.1 mg/L（以水相体积计），每克干细胞产量为3.8 mg，比对照（未处理）高42%。']
研究结论
研究表明，通过溶菌酶和EDTA处理重组E. coli使其形成球形体，可有效促进番茄红素从生物质萃取到有机相；构建的有机/水两相系统（以癸烷为有机相）使重组菌的番茄红素产量提高约40%。进一步优化原位产物回收过程有望提高产物浓度和生产力。