Chicken HS4 insulator significantly improves baculovirus-mediated foreign gene expression in insect cells by modifying the structure of neighbouring chromatin in virus minichromosome
- 作者
- Xin Wang, Li Li, Siyuan Ding, Xiaoxia Huang, Jing Zhang, Juan Yin, Jiang Zhong
- 单位
- Department of Microbiology and Microbial Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, PR China
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2009）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2009.06.012
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
杆状病毒表达系统（AcMNPV）中，外源基因的表达水平远低于野生型病毒的多角体蛋白，限制了该系统在生产重组蛋白中的应用。
研究策略
在杆状病毒基因组中，于多角体启动子驱动的外源基因表达盒下游插入鸡β-珠蛋白5'端HS4绝缘子（1.2 kb），利用绝缘子的屏障功能改变局部染色质结构，从而提高外源基因的转录和表达。
核心内容
该研究将鸡β-珠蛋白5'端HS4绝缘子插入杆状病毒多角体启动子驱动的外源基因表达盒下游，旨在提高外源基因在昆虫细胞中的表达水平。在Sf9和High5细胞中，HS4绝缘子使EGFP荧光强度在感染后48小时分别提高约6.7倍和3.0倍，荧光素酶活性在36小时提高约2倍，分泌型碱性磷酸酶产量在总培养物中48小时提高2.7倍。egfp mRNA水平在48小时提高3.2倍，证实转录增强。DNase I敏感性实验显示，HS4插入位点附近染色质对核酸酶更敏感，而距其35 kb的lef8位点则无差异；组蛋白乙酰转移酶抑制剂curcumin和garcinol可分别削弱该增强效应27%和60%。HS4效应呈方向依赖，反向插入无效，且不影响病毒复制。结果表明HS4通过增加局部组蛋白乙酰化和染色质松弛来增强基因表达，为优化杆状病毒表达系统提供了可行策略。
创新点
首次在杆状病毒裂解性表达载体中应用HS4绝缘子，并证明其通过增加组蛋白乙酰化和染色质松弛显著增强外源基因表达，且效应具有方向依赖性，并非增强子机制。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sf9 | 杆状病毒多角体启动子驱动的外源基因表达通路 | HS4 insulator | — | 调控 | 鸡β-珠蛋白5'HS4绝缘子，插入外源基因表达盒下游，通过改变染色质结构增强邻近基因转录 |
| Sf9 | 杆状病毒多角体启动子驱动的外源基因表达通路 | egfp | EGFP | 催化 | 增强绿色荧光蛋白报告基因，生色团形成具有自催化特性 |
| Sf9 | 杆状病毒多角体启动子驱动的外源基因表达通路 | luc | 萤火虫荧光素酶 | 催化 | 荧光素酶报告基因，催化荧光素氧化发光 |
| Sf9 | 杆状病毒多角体启动子驱动的外源基因表达通路 | seap | 分泌型碱性磷酸酶 | 催化 | 分泌型碱性磷酸酶报告基因，催化底物去磷酸化 |
| High5 | 杆状病毒多角体启动子驱动的外源基因表达通路 | egfp | EGFP | 催化 | 验证HS4对不同昆虫细胞系（T. ni High5）同样具有增强效应 |
| Sf9 | 杆状病毒多角体启动子驱动的外源基因表达通路 | polyhedrin promoter | — | 调控 | 杆状病毒极晚期强启动子，用于驱动外源基因表达 |
关键发现
- HS4绝缘子使EGFP荧光强度在感染后48、72、96 h分别提高约6.7倍（3899±276 vs 585±15）、3.0倍和2.1倍
- 在High5细胞中48 h提高约3.0倍（63500±2517 vs 21500±2517）。egfp mRNA水平在48 h和72 h分别提高3.2倍和1.7倍（以vp39 mRNA为内参）。荧光素酶活性在36 h提高约2倍（(6.57±0.01)×10^6 vs (3.21±0.35)×10^6）。SEAP在培养基中48 h和72 h分别提高1.4倍和1.3倍，在总培养物中分别提高2.7倍和2.9倍。HS4效应为方向依赖，反向插入时无增强。DNase I敏感性实验显示，0.5 U DNase I处理时，AcEGFP-HS4的egfp DNA 80%被降解，而AcEGFP仅约20%被降解
- 但距离HS4 35 kb的lef8位点对DNase I敏感性无差异。组蛋白乙酰转移酶抑制剂curcumin（25 μM）和garcinol（5 μM）分别使HS4介导的增强效应降低27%和60%。插入HS4不影响病毒复制（生长曲线一致）。
研究结论
鸡HS4绝缘子通过增加邻近染色质的组蛋白乙酰化并诱导染色质松弛，显著提高杆状病毒多角体启动子驱动的外源基因表达，且不显著影响病毒复制，为优化杆状病毒表达系统提供了新策略。