Investigation of cellular targeting of carotenoid pathway enzymes in Pichia pastoris
- 作者
- Pyung Cheon Lee, Young geol Yoon, Claudia Schmidt-Dannert
- 单位
- Department of Molecular Science and Technology, Ajou University; Department of Biotechnology, Ajou University; Department of Laboratory Medicine and Pathology and Institute of Human Genetics, University of Minnesota; Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, University of Minnesota
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2009）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2009.01.019
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在真核酵母毕赤酵母（Pichia pastoris）中，类胡萝卜素途径酶（CrtE、CrtB、CrtI）因膜结合特性而可能随机分布于细胞膜或细胞器膜上，其异源表达时缺乏正确的亚细胞定位；本研究探讨是否可通过过氧化物酶体靶向信号（PTS1）将这些酶定向导入过氧化物酶体，并验证其可行性。
研究策略
将番茄红素合成途径的三个酶（CrtE、CrtB、CrtI）分别与EGFP融合，并在融合蛋白C端添加或不添加过氧化物酶体靶向信号PTS1（SKL），构建8种整合型表达载体并转化毕赤酵母X-33；通过荧光显微镜观察不同碳源（YPD和YPOT）培养下的酶定位，并通过蔗糖梯度离心分离过氧化物酶体，进一步确认融合酶的亚细胞定位。
核心内容
本研究以毕赤酵母X-33为宿主，将番茄红素合成途径中的CrtE、CrtB、CrtI三个酶分别与EGFP融合，并在其C端添加或不添加过氧化物酶体靶向信号PTS1（SKL），构建了8种整合型表达载体。通过荧光显微镜观察和蔗糖梯度离心分离过氧化物酶体，验证了酶的亚细胞定位。结果显示，在YPD培养基中，无PTS1的融合蛋白均匀分布于整个细胞，而带PTS1的融合蛋白则聚集于1~2个过氧化物酶体斑点；在含油酸的YPOT培养基中，过氧化物酶体增殖，带PTS1的酶仍正确定位于增多的过氧化物酶体中。分离的过氧化物酶体荧光图像进一步证实，带PTS1的CrtE、CrtB、CrtI融合酶高浓度存在于过氧化物酶体中，而无PTS1的酶仅痕量非特异进入。此外，将CrtI-EGFP与CrtI-EGFP_pts分别与野生型CrtE和CrtB在大肠杆菌中共表达后，菌体变红，HPLC检测到番茄红素生成，表明融合酶在体内具有催化活性。这一结果表明PTS1信号强度足以克服类胡萝卜素酶自身的膜定位倾向，实现了对这些酶的强制过氧化物酶体靶向，为通过亚细胞区室化进行代谢通路工程奠定了基础。
创新点
['首次在重组宿主中证明类胡萝卜素合成酶可被定向靶向到特定细胞器（过氧化物酶体）', '证明PTS1信号足够强，能克服类胡萝卜素酶自身的固有靶向偏向', '建立了通过亚细胞区室化进行类胡萝卜素途径工程的基础方法']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris X-33 | 类胡萝卜素/番茄红素生物合成 | crtE | CrtE (GGPP合成酶) | 催化 | 融合EGFP，C端加或不加PTS1，观察其在过氧化物酶体定位 |
| Pichia pastoris X-33 | 类胡萝卜素/番茄红素生物合成 | crtB | CrtB (八氢番茄红素合成酶) | 催化 | 融合EGFP，C端加或不加PTS1 |
| Pichia pastoris X-33 | 类胡萝卜素/番茄红素生物合成 | crtI | CrtI (八氢番茄红素脱氢酶) | 催化 | 融合EGFP，C端加或不加PTS1；功能互补实验验证活性 |
| Pichia pastoris X-33 | 过氧化物酶体靶向 | PTS1 (编码SKL序列) | PTS1 (过氧化物酶体靶向信号1) | 区室化 | 融合在酶-EGFP的C端，将蛋白导入过氧化物酶体 |
| Escherichia coli | 番茄红素生物合成 | crtI | CrtI (八氢番茄红素脱氢酶) | 催化 | 与CrtE、CrtB共表达验证融合酶活性，HPLC检测到番茄红素 |
关键发现
- 在YPD培养基中，无PTS1的酶-EGFP融合蛋白均匀分布于整个细胞，而带PTS1的融合蛋白则聚集于1~2个过氧化物酶体斑点
- 在YPOT（含油酸）培养基中，过氧化物酶体增殖，带PTS1的融合蛋白依然正确定位于增多的过氧化物酶体，无PTS1的酶仍均匀分布。分离的过氧化物酶体荧光图像显示，带PTS1的CrtE、CrtB、CrtI融合酶高浓度存在于过氧化物酶体中，而无PTS1的酶仅痕量非特异进入。CrtI-EGFP与CrtI-EGFP_pts分别与野生型CrtE和CrtB在大肠杆菌中共表达后，大肠杆菌变红，且HPLC检测到番茄红素生成，表明融合酶在体内有活性。
研究结论
PTS1能够将类胡萝卜素合成途径酶（CrtE、CrtB、CrtI）特异性地靶向到毕赤酵母的过氧化物酶体，且该靶向信号强度足以克服这些酶自身的膜定位倾向。该研究为在微生物中通过亚细胞区室化实现精细代谢通路工程奠定了基础。