Bioconversion of car-3-ene by a dioxygenase of Pleurotus sapidus
- 作者
- Nicole Lehnert, Ulrich Krings, Daniel Sydes, Maximilian Wittig, Ralf G. Berger
- 单位
- Institut für Lebensmittelchemie, Leibniz Universität Hannover, Callinstrasse 5, D-30167 Hannover, Germany
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2011.06.007
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用Pleurotus sapidus的双加氧酶对(+)-car-3-ene进行区域和立体选择性氧化，以获得有价值的萜类香料化合物，并阐明其与自氧化不同的酶催化机制。
研究策略
使用P. sapidus菌丝体匀浆在HEPES缓冲液中添加底物(+)-car-3-ene进行生物转化，通过HRGC-MS和NMR鉴定产物，合成标准品确认结构，并用NaBH4还原氢过氧化物以验证中间体，同时设置热灭活匀浆的自氧化对照，比较产物分布和比例。
核心内容
本研究利用 Pleurotus sapidus 的双加氧酶对 (+)-car-3-ene 进行区域与立体选择性氧化，旨在获得高价值萜类香料并阐明其酶催化机制。实验中以菌丝体匀浆在 HEPES 缓冲液中添加底物进行生物转化，通过 HRGC-MS 和 NMR 鉴定产物结构，并以热灭活匀浆自氧化为对照。生物转化 4 小时后，主要产物 car-3-en-5-one 积累至 25.3 mg/L，而自氧化对照仅 0.9 mg/L，所有氧化产物峰面积平均高出自氧化至少 5 倍；同时检出 car-2-en-4-one 7.3 mg/L、car-3-en-2-one 5.4 mg/L 及多种醇类产物。产物分析证实酶催化优先发生在 C5 位并生成 trans-氢过氧化物，NaBH4 还原后 cis/trans 比例倒置，证明 trans-car-3-en-5-hydroperoxide 优先形成，揭示了自由基反应机制。该双加氧酶无需辅因子即可实现烯丙位氧化，为 P450 单加氧酶提供了绿色替代方案，适用于香料和精细化学品的可持续生产，但需控制反应时间以抑制氢过氧化物引发的自氧化副反应。
创新点
首次报道P. sapidus双加氧酶对car-3-ene的区域和立体选择性氧化；证明该酶无需辅因子即可催化烯丙位氧化，为P450单加氧酶提供了替代方案；通过详细产物分析证实了自由基反应机制。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pleurotus sapidus | 萜烯生物转化（car-3-ene氧化） | — | Dioxygenase（双加氧酶） | 催化 | 催化(+)-car-3-ene烯丙位氢过氧化，生成carenones和carenols |
关键发现
- 生物转化4 h后，主要产物car-3-en-5-one [V]积累至25.3 mg/L，car-3-en-2-one [VII]为5.4 mg/L，car-2-en-4-one [XV]为7.3 mg/L
- 所有氧化产物峰面积平均比自氧化高至少5倍，其中car-3-en-5-one的比值更高（自氧化仅0.9 mg/L）
- 还检出cis/trans-car-3-en-5-ol (8.1 mg/L)、cis/trans-car-3-en-2-ol (1.6 mg/L)、cis/trans-car-2-en-4-ol (2.4 mg/L)、α-phellandren-8-ol (2.9 mg/L)等。双加氧酶催化主要发生在C5位，生成trans-氢过氧化物，NaBH4还原后cis/trans比例倒置，证实trans-car-3-en-5-hydroperoxide优先形成。
研究结论
P. sapidus双加氧酶可区域和立体选择性地将分子氧引入单萜和倍半萜的烯丙位，优先选择C-C双键非取代碳相邻的烯丙位，且不依赖辅因子，适用于香料、药物等精细化学品的绿色生产，但需控制反应时间以避免氢过氧化物引发的自氧化和聚合。