Coupling of permeabilized cells of Gluconobacter oxydans and Ralstonia eutropha for asymmetric ketone reduction using H2 as reductant
- 作者
- Fabian Rundbäck, Milica Fidanoska, Patrick Adlercreutz
- 单位
- Department of Biotechnology, Lund University, P.O. Box 124, SE-221 00 Lund, Sweden
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2011.09.029
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
使用H2作为还原剂，实现高效、无副产物的辅因子再生，用于不对称酮还原。
研究策略
将含可溶性氢化酶的Ralstonia eutropha透化细胞与含酮还原酶的Gluconobacter oxydans透化细胞偶联，在双相水/有机体系中以H2再生NADH，驱动2-辛酮还原为(S)-2-辛醇。
核心内容
本研究将含有可溶性氢化酶的Ralstonia eutropha透化细胞与含酮还原酶的Gluconobacter oxydans透化细胞偶联，构建双细胞体系，以H2为还原剂再生NADH，驱动2-辛酮不对称还原为(S)-2-辛醇。两种细胞均经EDTA/甲苯透化处理，在双相水/有机体系中进行反应，避免了酶纯化并提高了稳定性。结果显示，该双细胞系统的初始反应速率达450 μmol h⁻¹ g⁻¹（基于G. oxydans用量），约为传统2-丁醇底物偶联系统（266 μmol h⁻¹ g⁻¹）的2倍；最终产率达75%，显著高于对照的48%。产物(S)-2-辛醇的对映体过量约为93%，略低于2-丁醇系统的98%。反应约6天后因酶失活而停止，NAD⁺浓度在0.2至3 mM范围内均优于对照系统。该研究首次将氢化酶全细胞催化剂与另一全细胞催化剂组合用于不对称还原，利用H2作为还原剂可避免副产物生成，简化产物纯化，为工业上辅因子再生提供了一种高效且环保的新策略。
创新点
['首次将氢化酶全细胞催化剂与另一全细胞催化剂组合用于不对称还原', '利用H2作为还原剂，无副产物生成', '采用EDTA/甲苯透化处理的全细胞，避免酶纯化，提高稳定性']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Gluconobacter oxydans (DSM 50049) | 2-辛酮不对称还原为(S)-2-辛醇 | — | 2-酮还原酶（酮还原酶） | 催化 | 透化细胞，负责不对称还原反应 |
| Ralstonia eutropha (DSM 428) | H2氧化与NADH再生（辅因子再生） | — | 可溶性氢化酶 | 能量供给 | 透化细胞，利用H2还原NAD+生成NADH，无副产物 |
关键发现
- 双细胞系统初始反应速率达450 μmol h-1 g-1（基于G. oxydans用量），是单细胞2-丁醇系统（266 μmol h-1 g-1）的近2倍
- 最终产率为75%（对比48%）
- 产物(S)-2-辛醇对映体过量93%（对比98%）。最佳2-丁醇浓度为400 mM时初始速率为266 μmol h-1 g-1
- 双细胞系统中NAD+浓度在0.2-3 mM范围内均高于2-丁醇系统
- 最高产率约75%，反应约6天后停止，可能因酶失活
- 对映体过量在90-95%区间。
研究结论
本研究证明R. eutropha全细胞可作为辅因子再生系统与G. oxydans全细胞耦合进行不对称酮还原，利用H2作为还原剂可获得高于传统底物偶联和FDH/甲酸系统的初始反应速率，但产物对映体纯度略低；该双细胞方法可避免副产物，便于产物纯化，可根据需求选择辅因子再生方法。