高级醇 · 代谢工程文献库

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Effects of NADH-preferring xylose reductase expression on ethanol production from xylose in xylose-metabolizing recombinant Saccharomyces cerevisiae

作者
Sung-Haeng Lee, Tsutomu Kodaki, Yong-Cheol Park, Jin-Ho Seo
单位
Interdisciplinary Program for Bioengineering, Seoul National University, Seoul 151-742, Republic of Korea; Institute of Advanced Energy, Kyoto University, Gokasho, Uji, Kyoto 611-0011, Japan; Department of Advanced Fermentation Fusion Science and Technology, Kookmin University, Seoul 136-702, Republic of Korea; Department of Agricultural Biotechnology, Seoul National University, Seoul 151-742, Republic of Korea
杂志
Journal of Biotechnology（2011）
DOI
10.1016/j.jbiotec.2011.06.005
所属领域
代谢工程
关键词
NADH偏好型木糖还原酶乙醇木糖酿酒酵母
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解决的核心问题

重组酿酒酵母在木糖代谢中存在辅因子不平衡（XR偏好NADPH，XDH依赖NAD+），导致大量副产物木糖醇积累，乙醇产率低，制约木质纤维素乙醇商业化。

研究策略

通过表达NADH偏好型木糖还原酶突变体（XR^MUT，R276H）与NAD+依赖的木糖醇脱氢酶（XDH），并过表达内源木酮糖激酶（XK）和转醛醇酶（Tal），敲除乙醛脱氢酶基因ALD6，平衡辅因子利用并优化戊糖磷酸途径与乙醇代谢通量。

研究路线图

100%
核心问题：重组酿酒酵母木糖代谢辅因子失衡，木糖醇积累，乙醇产率低
策略：表达NADH偏好型XR^MUT并协同改造
关键改造1：XR^MUT（R276H）替代野生型XR
关键改造2：过表达XK与Tal
关键改造3：敲除ALD6基因
主要结果：木糖醇积累降低至0.24 g/L，乙醇产率提升至41.7%
结论：辅因子平衡改造显著提升木糖乙醇转化效率
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核心内容

该研究针对重组酿酒酵母木糖代谢中辅因子不平衡导致木糖醇大量积累、乙醇产率低下的问题，构建了一系列代谢工程改造菌株。研究者以酿酒酵母D452-2为底盘，引入NADH偏好型木糖还原酶突变体（XR^MUT，R276H）替代野生型NADPH依赖的XR，并与NAD+依赖的木糖醇脱氢酶（XDH）联用，同时过表达木酮糖激酶（XK）和转醛醇酶（Tal），并敲除乙醛脱氢酶基因ALD6，以平衡辅因子并优化通量分配。结果显示，在氧气受限发酵中，最优菌株SX6^MUT的木糖消耗速率为0.64 g/L/h，乙醇产率达39%，较仅表达XR^MUT、XDH和XK的菌株分别提升4.2倍和2.2倍；木糖醇积累从野生型对照的10.6 g/L降至0.24 g/L。进一步过表达Tal并敲除ALD6后，微好氧发酵乙醇产量达20.7 g/L，氧气受限下由68.5 g/L木糖和51.5 g/L葡萄糖产生50 g/L乙醇，产率41.7%，生产力0.50 g/L/h。该策略有效解决了辅因子失衡问题，为木质纤维素乙醇生产提供了高效菌株构建方案。

创新点

首次将XR的R276H突变与XDH、XK过表达及ALD6敲除相结合，显著减少木糖醇积累；通过多重代谢工程改造实现氧气受限条件下乙醇产率的大幅提升。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae D452-2 木糖代谢途径 XYL1 (wild type) Xylose reductase (XR^WT) 催化 来自Pichia stipitis，偏好NADPH，催化木糖还原为木糖醇；作为对照。
Saccharomyces cerevisiae D452-2 木糖代谢途径 XYL1 (R276H) Xylose reductase (XR^MUT) 催化 NADH偏好型突变体，用于平衡辅因子，减少木糖醇积累。
Saccharomyces cerevisiae D452-2 木糖代谢途径 XYL2 Xylitol dehydrogenase (XDH) 催化 来自Pichia stipitis，NAD+依赖，催化木糖醇氧化为木酮糖。
Saccharomyces cerevisiae D452-2 木糖代谢途径/磷酸戊糖途径 XKS1 Xylulokinase (XK) 催化 内源木酮糖激酶，催化木酮糖磷酸化生成木酮糖-5-磷酸。
Saccharomyces cerevisiae D452-2 磷酸戊糖途径 PstAL1 Transaldolase (Tal) 催化 来自Pichia stipitis，转醛醇酶，促进磷酸戊糖途径碳流。
Saccharomyces cerevisiae D452-2 乙醛/乙酸代谢 ALD6 Aldehyde dehydrogenase 6 (Ald6p) 催化 乙醛脱氢酶，催化乙醛生成乙酸；本研究通过敲除该基因减少乙酸积累，缓解对木糖代谢的抑制。

关键发现

  1. 氧气限制发酵中，重组菌SX6^MUT的木糖消耗速率为0.64 g/L/h，乙醇生产力为0.25 g/L/h，乙醇产率为39%（基于消耗木糖），分别为仅表达XR^MUT、XDH和XK菌株的1.8倍、4.2倍和2.2倍
  2. XR^MUT表达使木糖醇积累从野生型对照的10.6 g/L（产率0.33 g/g）降至0.24 g/L
  3. XK过表达使木糖消耗量从12.1 g/L增至29.5 g/L，微好氧下乙醇产率17.5%
  4. 额外过表达XR^MUT和Tal使乙醇产量从5.05 g/L增至10.6 g/L
  5. ALD6敲除后微好氧发酵乙醇产量达20.7 g/L，氧气受限发酵中50 g/L乙醇和1.6 g/L木糖醇由68.5 g/L木糖和51.5 g/L葡萄糖产生，乙醇产率41.7%，生产力0.50 g/L/h。

研究结论

通过引入NADH偏好型XR突变体并协同过表达XK、Tal以及敲除ALD6，有效解决了辅因子不平衡问题，大幅降低木糖醇积累并提高木糖至乙醇的转化效率，为木质纤维素乙醇生产提供了高效菌株策略。