Bioconversion of major ginsenosides Rg1 to minor ginsenoside F1 using novel recombinant ginsenoside hydrolyzing glycosidase cloned from Sanguibacter keddieii and enzyme characterization
- 作者
- Jin-Kwang Kim, Chang-Hao Cui, Min-Ho Yoon, Sun-Chang Kim, Wan-Taek Im
- 单位
- KAIST Institute for Biocentury, Korea Advanced Institute of Science and Technology; Department of Bio-Environmental Chemistry, College of Agriculture and Life Sciences, Chungnam National University; Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2012.06.021
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
主要人参皂苷（Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1）在人体胃肠道吸收差，需转化为更易吸收且药理活性更强的稀有皂苷（如F1），但缺乏高效、特异且可重组表达的转化酶，尤其是能选择性将Rg1转化为F1的克隆酶。
研究策略
从Sanguibacter keddieii KACC 14479T中克隆推测的β-葡萄糖苷酶基因bgISk，构建pGEX 4T-1-GST融合表达载体，在Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达并纯化，通过酶学表征和多种人参皂苷底物的生物转化实验研究其底物特异性和转化途径。
核心内容
该研究从Sanguibacter keddieii KACC 14479T中克隆了一个编码β-葡萄糖苷酶的基因bgISk，并在大肠杆菌BL21(DE3)中以GST融合形式实现了可溶性表达和纯化。该基因全长1857 bp，编码618个氨基酸，属于糖苷水解酶家族3。重组酶GST-BglSk的最适pH为8.0，最适温度为25°C，在30°C和37°C下活性分别降低15%和25%。以pNPGlc为底物时Km为0.456 mM，Vmax为30.2 μmol min⁻¹ mg⁻¹；以Rb1为底物时Km为0.167 mM，Vmax为4.1 μmol min⁻¹ mg⁻¹。该酶能转化8种人参皂苷底物，其中Rg1在2小时内被完全转化为F1，Rb1经GypXVII和GypLXXV生成C-K，Rb2生成C-Y，Rc生成C-Mc，Re主要生成Rg2(S)和F1。这是首次报道能选择性水解Rg1 C6位葡萄糖基并完全转化为F1的克隆重组酶，其广泛的底物特异性和温和反应条件为稀有皂苷C-K和F1的大规模制备提供了实用工具。
创新点
首次报道了能通过选择性水解Rg1的C6位葡萄糖基而将其完全转化为F1的克隆重组酶；该酶还能水解Re生成Rg2(S)和F1，且能转化多种PPD型人参皂苷生成C-K、C-Y、C-Mc等稀有皂苷，具有广泛的底物特异性和独特的转化途径。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 人参皂苷生物转化 | bgISk | BglSk | 催化 | 重组β-葡萄糖苷酶（糖苷水解酶家族3），来源于Sanguibacter keddieii，通过GST融合表达，可水解人参皂苷的葡萄糖基，选择性转化Rg1生成F1。 |
关键发现
- 基因bgISk长1857 bp，编码618个氨基酸，属于糖苷水解酶家族3
- 重组酶GST-BglSk最适pH 8.0、最适温度25°C，在30°C和37°C活性分别降低15%和25%
- 以pNPGlc为底物时Km=0.456±0.009 mM，Vmax=30.2±0.7 μmol min⁻¹ mg⁻¹，以Rb1为底物时Km=0.167±0.003 mM，Vmax=4.1±0.1 μmol min⁻¹ mg⁻¹
- 能转化Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1、Gyp XVII和Rg3(S)等8种人参皂苷，其中Rg1在2小时内完全转化为F1，Rb1经GypXVII、GypLXXV转化为C-K，Rb2转化为C-Y，Rc转化为C-Mc，Re主要生成Rg2(S)和F1。
研究结论
成功构建并表征了来自Sanguibacter keddieii的重组人参皂苷水解糖苷酶BglSk，该酶属于GH3家族，能在温和条件下高效转化多种主要人参皂苷为稀有皂苷，特别是能完全将Rg1转化为F1，为大规模制备C-K和F1提供了实用工具。