Homologous overexpression of xylanase in Fusarium oxysporum increases ethanol productivity during consolidated bioprocessing (CBP) of lignocellulosics
- 作者
- George E. Anasontzis, Anastasia Zerva, Panagiota M. Stathopoulou, Kosmas Haralampidis, George Dailinas, Amalia D. Karagouni, Dimitris G. Hatzinikolaou
- 单位
- Laboratory of Microbiology, Sector of Botany, Department of Biology, National and Kapodistrian University of Athens; Molecular Plant Development Laboratory, Sector of Botany, Department of Biology, National and Kapodistrian University of Athens
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2011.01.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
木质纤维素联合生物加工（CBP）中，水解酶产量不足导致乙醇生产效率低下，需要提高关键水解酶（木聚糖酶）的表达水平以增加糖供应和乙醇产量。
研究策略
通过农杆菌介导转化，在尖孢镰孢菌F3中利用构巢曲霉gpdA组成型启动子同源过表达内切-β-1,4-木聚糖酶2基因（xylanase 2），评估转化子在玉米芯和麦麸CBP中的乙醇生产性能。
核心内容
该研究通过在尖孢镰孢菌F3中利用构巢曲霉gpdA组成型启动子同源过表达内切-β-1,4-木聚糖酶2基因，以增强木质纤维素联合生物加工（CBP）中的糖供应和乙醇产量。经农杆菌介导转化获得12株潮霉素抗性菌株，Southern blot证实转化株至少额外整合2个xylanase 2基因拷贝。在葡萄糖抑制条件下，转化株Fx10和Fx13胞外木聚糖酶活最高分别达250和230 nkat/mL，而野生型仅痕量。在玉米芯CBP中，两转化株最大乙醇浓度分别为2.68和2.85 g/L，较野生型1.90 g/L提高约50%；麦麸CBP中Fx13乙醇浓度达8.83 g/L，比野生型高60%，转化率和理论得率分别达222 g/kg和56%，为同类文献最高。过表达木聚糖酶可使乙醇生产率在玉米芯上提升95%、麦麸上提升25%。该策略首次证明在天然木质纤维素降解菌中同源组成型过表达关键水解酶可显著提高CBP乙醇产量。
创新点
首次在尖孢镰孢菌F3中实现关键木聚糖酶的同源组成型过表达，并证明该策略能提高复杂农业副产物CBP的乙醇产量；在未优化工艺条件下，转化株Fx13在麦麸上的转化率和理论得率分别达到222 g/kg和56%，为同类文献最高。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Fusarium oxysporum F3 | 木聚糖降解与乙醇发酵 | xylanase 2 (endo-β-1,4-xylanase 2) | endo-β-1,4-xylanase 2 | 催化 | 目标过表达基因，受构巢曲霉gpdA启动子驱动组成型表达 |
| Fusarium oxysporum F3 | 糖酵解/戊糖发酵 | gpdA promoter (Aspergillus nidulans) | — | 调控 | 组成型启动子，用于驱动xylanase 2基因表达 |
| Fusarium oxysporum F3 | 木聚糖降解 | xylanase 1 gene (FOXG_15742.2) | xylanase 1 | 催化 | 与xylanase 2高度相似，Southern blot中表现为较弱条带 |
| Fusarium oxysporum F3 | 纤维素降解 | — | endo-glucanase (CMCase) | 催化 | CBP过程中检测的胞外内切葡聚糖酶活性 |
| Fusarium oxysporum F3 | 淀粉降解 | — | amylase | 催化 | 麦麸含29%淀粉，诱导生产显著淀粉酶；Fx10转化株淀粉酶活性降低影响麦麸乙醇产量 |
| Agrobacterium tumefaciens AGL1 | T-DNA介导转化 | vir genes (via A. tumefaciens) | — | 调控 | 用于介导F. oxysporum F3的转化，质粒pBHtxyl携带xyl2表达盒 |
关键发现
- 转化获得12株潮霉素抗性菌株，其中Fx10和Fx13在葡萄糖为唯一碳源的抑制条件下胞外木聚糖酶活最高分别达250 nkat/mL和230 nkat/mL（野生型仅痕量）。Southern blot证实转化株至少含有额外2个xylanase 2基因拷贝。在葡萄糖培养中，转化株xylanase 2 mRNA信号极强，而野生型无信号
- 在木聚糖培养中转化株mRNA信号显著强于野生型，但胞外木聚糖酶活仅比野生型高5-10%。SDS-PAGE显示转化株胞内无木聚糖酶2积累，排除了分泌饱和。在玉米芯CBP中，Fx10和Fx13的最大乙醇浓度分别为2.68 g/L和2.85 g/L，野生型为1.90 g/L，转化株产量提高约50%
- 培养液中木聚糖酶活为420和500 nkat/mL，野生型为215 nkat/mL。在麦麸CBP中，Fx13乙醇浓度达8.83 g/L，比野生型和Fx10的约5.5 g/L高60%
- Fx10因淀粉酶活性受负面影响未表现出增产。Fx13在玉米芯上的转化率、理论得率和生产率分别提高48%、49%和95%，在麦麸上分别提高60%、61%和25%。
研究结论
在天然木质纤维素降解菌尖孢镰孢菌F3中同源组成型过表达关键水解酶木聚糖酶2，可显著提高其在CBP中的乙醇产量，证明该策略可行，为利用野生型天然分解菌进行CBP遗传改造提供了概念验证。