Development of an intra-molecularly shuffled efficient chimeric plant promoter from plant infecting Mirabilis mosaic virus promoter sequence
- 作者
- Sefali Acharya, Soumika Sengupta, Sunita Patro, Sukumar Purohit, Sabindra Samal, Indu B. Maiti, Nrisingha Dey
- 单位
- Division of Gene Function and Regulation, Institute of Life Sciences, Department of Biotechnology, Government of India, Nalco Square, Chandrasekharpur, Bhubaneswar 751 023, Odisha, India; Plant Genetic Engineering & Service, KTRDC, University of Kentucky, Lexington, KY 40546-0236, USA
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2013.08.022
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
植物基因工程中广泛使用的单一启动子（如CaMV35S）在多基因叠加表达时易引发基因沉默和遗传重组，亟需开发活性更强、性质可控的新型嵌合启动子作为替代。
研究策略
采用分子内改组策略，将Mirabilis mosaic virus（MMV）全长转录启动子的上游激活序列（UAS，-297至-38）与含TATA盒的亚基因组转录启动子片段（MSCP，-306至-125）融合，构建嵌合启动子MUASMSCP，并通过瞬时表达（烟草/拟南芥原生质体、矮牵牛全株）、稳定转基因分析及多种报告基因（GUS、GFP、IL-24）验证其活性。
研究路线图
核心内容
该研究利用分子内改组策略，将Mirabilis mosaic virus（MMV）全长启动子的上游激活序列（UAS，-297至-38）与含TATA盒的亚基因组启动子片段（MSCP，-306至-125）融合，构建了新型嵌合启动子MUASMSCP。研究在烟草、拟南芥原生质体及矮牵牛全株中进行瞬时表达，并通过稳定转基因烟草分析，以GUS、GFP和IL-24作为报告基因验证其活性。结果显示，MUASMSCP在烟草原生质体中的GUS活性为CaMV35S的1.5倍，在矮牵牛中达3.2倍；在转基因烟草中其活性为CaMV35S2的2.2倍，GFP荧光强度为CaMV35S的2.1倍，IL-24蛋白积累量为CaMV35S的1.7倍，且该IL-24对DU-145癌细胞的抑制活性高于CaMV35S驱动表达的1.34倍。此外，该启动子具有SA/ABA诱导性，在150μM ABA处理下活性比CaMV35S2高约2倍，且根部表达优势明显。研究表明MUASMSCP可作为CaMV35S/CaMV35S2的高效替代启动子，在植物及动物细胞转基因表达中具有应用潜力。
创新点
首次构建了由MMV UAS与MSCP融合的新型嵌合启动子MUASMSCP，其活性显著高于CaMV35S且具有SA/ABA诱导性；在植物和动物细胞中均表现出高效的表达能力，并可驱动具有生物学活性的IL-24蛋白生产，有望成为CaMV35S/CaMV35S2的高效替代启动子。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草 (Nicotiana tabacum)，拟南芥 (Arabidopsis thaliana)，矮牵牛 (Petunia hybrida) | 外源基因表达 | uidA | GUS | 催化 | β-葡萄糖醛酸酶报告基因，用于启动子活性分析 |
| 烟草原生质体 | 外源基因表达 | GFP | GFP | 调控 | 绿色荧光蛋白报告基因，用于启动子活性比较 |
| 烟草原生质体 | 外源蛋白表达 | IL-24 | IL-24 | 调控 | 人白细胞介素-24，具有肿瘤抑制活性 |
| DU-145 人前列腺癌细胞 | 细胞增殖调控 | IL-24 | IL-24 | 调控 | 用于检测启动子驱动IL-24的生物学活性 |
| — | 基因表达调控 | MUASMSCP | — | 调控 | 新开发的嵌合启动子，由MMV UAS与MSCP融合而成，活性增强并受SA/ABA诱导 |
| — | 基因表达调控 | CaMV35S | — | 调控 | 花椰菜花叶病毒35S启动子，作为对照 |
| — | 基因表达调控 | CaMV35S2 | — | 调控 | 增强型CaMV35S启动子，作为对照 |
关键发现
- 在烟草原生质体中，MUASMSCP启动子的GUS活性是MUAS35SCP的1.1倍、CaMV35S的1.5倍
- 在拟南芥原生质体中为CaMV35S的1.8倍
- 在矮牵牛全株中为CaMV35S的3.2倍、MUAS35SCP的1.3倍。在转基因烟草中，其活性为MUAS35SCP的1.1倍（摘要）/1.2倍（结果）和CaMV35S2的2.2倍（摘要）/1.5倍（结果）。GFP荧光强度为CaMV35S的2.1倍、MUAS35SCP的1.3倍
- IL-24蛋白积累量为CaMV35S的1.7倍、MUAS35SCP的1.1倍
- 对DU-145癌细胞的抑制活性为CaMV35S的1.34倍、MUAS35SCP的1.33倍。在150μM ABA处理24和48h时，MUASMSCP活性比CaMV35S2分别高2.0倍和2.1倍。空间分布分析显示，其根表达比MUAS35SCP高1.7倍、比CaMV35S2高6.4倍，且根表达是叶的2.3倍、茎的15.3倍。
研究结论
新开发的嵌合启动子MUASMSCP具有增强的组成型表达活性，且受SA/ABA诱导，可高效驱动GUS、GFP和IL-24的表达，其中IL-24对DU-145前列腺癌细胞显示出更强的抑制作用。MUASMSCP可作为CaMV35S/CaMV35S2的高效替代启动子，在植物和动物细胞的转基因表达中有广泛应用前景。