Toward pectin fermentation by Saccharomyces cerevisiae: Expression of the first two steps of a bacterial pathway for D-galacturonate metabolism
- 作者
- Eline H. Huisjes, Marijke A.H. Luttik, Marinka J.H. Almering, Markus M.M. Bisschops, Dieu H.N. Dang, Michiel Kleerebezem, Roland Siezen, Antonius J.A. van Maris, Jack T. Pronk
- 单位
- Department of Biotechnology, Delft University of Technology and Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation, Julianalaan 67, 2628 BC Delft, The Netherlands; NIZO Food Research, PO Box 20, 6710 BA Ede, The Netherlands; Centre for Molecular and Biomolecular Informatics (CMBI), Radboud University Nijmegen Medical Centre, PO Box 9101, 6500 HB, The Netherlands; TI Food and Nutrition, PO Box 557, 6700 AN Wageningen, The Netherlands; Netherlands Bioinformatics Centre (NBIC), PO Box 9101, The Netherlands
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2012.10.003
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母不能代谢果胶的重要单体D-半乳糖醛酸，需引入细菌D-半乳糖醛酸代谢途径以利用果胶丰富原料生产乙醇等产品。本研究旨在实现该细菌途径前两步酶（D-半乳糖醛酸异构酶和D-塔格糖醛酸还原酶）在酿酒酵母中的功能性表达。
研究策略
克隆并密码子优化多个细菌来源的uxaC基因，在酿酒酵母中表达D-塔格糖醛酸还原酶（uxaB）作为偶联酶，通过体外酶活筛选最佳异构酶；同时在gpd1Δgpd2Δ菌株中表达uxaC和uxaB，考察体内D-半乳糖醛酸转化能否替代甘油途径实现NADH再氧化。
核心内容
该研究旨在为酿酒酵母引入细菌来源的D-半乳糖醛酸代谢途径，以利用果胶丰富原料生产乙醇。研究者克隆并密码子优化了六个细菌来源的uxaC基因（编码D-半乳糖醛酸异构酶），在酿酒酵母中与D-塔格糖醛酸还原酶（uxaB）共表达，通过体外酶活筛选最佳异构酶，并在gpd1Δgpd2Δ菌株中考察该途径能否替代甘油途径实现NADH再氧化。 结果显示，乳酸乳球菌KF147来源的uxaC表达活性最高，达0.46 μmol min⁻¹ mg⁻¹蛋白，比次优来源高约10倍；uxaB活性达6.3 μmol min⁻¹ mg⁻¹蛋白。基于33%可溶性蛋白假设，该异构酶活性对应的体内D-半乳糖醛酸转化速率约9 mmol g⁻¹ h⁻¹，足以支持快速酒精发酵。然而，在gpd1Δgpd2Δ菌株中，添加D-半乳糖醛酸未能恢复厌氧生长，野生型及工程菌株经8周培养均未出现D-半乳糖醛酸共消耗，提示体内应用受限于D-阿卓糖酸外排。该研究成功实现了细菌途径前两步酶在真核宿主中的功能性表达，为后续构建完整代谢途径奠定了基础。
创新点
['首次在真核宿主中成功表达细菌异构酶型D-半乳糖醛酸代谢途径的酶', '发现乳酸乳球菌KF147来源的uxaC基因在酿酒酵母中表达活性最高，比其它五个来源高10倍', '利用gpd1Δgpd2Δ突变体从生理层面揭示了D-半乳糖醛酸途径体内应用可能受限于D-阿卓糖酸外排']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK系列) | 细菌D-半乳糖醛酸代谢途径 | uxaC | D-半乳糖醛酸异构酶 (EC 5.3.1.12) | 催化 | 来自L. lactis KF147的密码子优化基因活性最高（0.46 μmol min^-1 mg^-1蛋白）；其他来源包括E. coli、C. acetobutylicum、R. sphaeroides、B. amyloliquefaciens、B. thetaiotaomicron，活性均低于0.05 μmol min^-1 mg^-1蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK系列) | 细菌D-半乳糖醛酸代谢途径 | uxaB | D-塔格糖醛酸还原酶 (EC 1.1.1.58) | 催化 | 来自L. lactis KF147，NADH依赖，高表达时活性达6.3±0.5 μmol min^-1 mg^-1蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK系列) | 细菌D-半乳糖醛酸代谢途径 | uxaA | D-阿卓糖酸脱水酶 (EC 4.2.1.7) | 催化 | 来自L. lactis KF147，因底物不可得未测定活性，mRNA表达经qPCR确认 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK系列) | 细菌D-半乳糖醛酸代谢途径 | kdgK | 2-酮-3-脱氧葡糖酸激酶 (EC 2.7.1.45) | 催化 | 来自L. lactis KF147，因底物不可得未测定活性，mRNA表达经qPCR确认 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK系列) | 细菌D-半乳糖醛酸代谢途径 | kdgA | 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶 (EC 4.1.2.14) | 催化 | 来自L. lactis KF147，因底物不可得未测定活性，mRNA表达经qPCR确认 |
关键发现
- D-塔格糖醛酸还原酶（L. lactis uxaB）在酿酒酵母中获得高表达，细胞提取物活性为6.3±0.5 μmol min^-1 mg^-1蛋白。在六个密码子优化的细菌uxaC基因中，L. lactis来源的D-半乳糖醛酸异构酶活性最高（0.46±0.05 μmol min^-1 mg^-1蛋白），比次优的B. thetaiotaomicron来源（0.045±0.006）高约10倍
- 非密码子优化的L. lactis uxaC活性为0.36±0.02。单拷贝整合菌株IM1005中uxaC和uxaB活性分别为0.08±0.01和0.68±0.07 μmol min^-1 mg^-1蛋白，多拷贝菌株IME092分别为0.18±0.02和1.55±0.24。基于33%可溶性蛋白假设，异构酶活性0.46 μmol min^-1 mg^-1蛋白对应体内D-半乳糖醛酸转化速率约9 mmol g^-1 h^-1，足以支持快速酒精发酵。然而，在gpd1Δgpd2Δ菌株中，添加D-半乳糖醛酸未能恢复厌氧生长，提示缺乏功能性D-阿卓糖酸外排蛋白。野生型及工程菌株经8周培养均未出现生长或D-半乳糖醛酸共消耗。
研究结论
细菌D-半乳糖醛酸途径的前两个酶——D-半乳糖醛酸异构酶和D-塔格糖醛酸还原酶——已在酿酒酵母中成功功能性表达。L. lactis uxaC基因表达水平最高，可作为后续构建完整D-半乳糖醛酸代谢途径的基础，为利用果胶丰富原料生产生物乙醇奠定第一步。