The main byproducts and metabolic flux profiling of γ-PGA-producing strain B. subtilis ZJU-7 under different pH values
- 作者
- Fan Zhu, Jin Cai, Xiangting Wu, Jin Huang, Lei Huang, Jianzhong Zhu, Qiang Zheng, Peilin Cen, Zhinan Xu
- 单位
- Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering (Ministry of Education), Department of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University; Institute of Biological Engineering, Department of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University; School of Life and Environmental Science, Wenzhou University; Zhejiang Deguing Huiting Biotechnology Corp. Ltd.
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2012.12.009
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究γ-PGA产生菌B. subtilis ZJU-7在发酵后期高粘度、低溶氧条件下主要副产物（acetoin和2,3-丁二醇）对菌体生长及γ-PGA合成的影响，并揭示不同pH值下代谢通量再分配与γ-PGA产量的关系。
研究策略
通过摇瓶添加副产物模拟发酵过程，评估acetoin和2,3-BDO对细胞生长和γ-PGA产量的影响；在10-L发酵罐中控制不同pH值（5.7、6.5、7.3）进行补料分批发酵，测定胞外代谢物和气体交换参数，利用代谢通量平衡模型计算中心碳代谢通量分布。
核心内容
该研究系统探究了γ-聚谷氨酸（γ-PGA）产生菌枯草芽孢杆菌ZJU-7在不同pH条件下主要副产物对菌体生长和目标产物合成的影响。作者首先通过摇瓶外源添加实验确认，acetoin和2,3-丁二醇（2,3-BDO）是发酵过程中积累的主要副产物，且二者对菌体均有明显抑制作用：添加2 g/L acetoin时菌体量降至对照的约25%，而30 g/L 2,3-BDO可使γ-PGA产量由29.06 g/L降至15.36 g/L。随后在10-L发酵罐中控制pH 5.7、6.5和7.3进行补料分批发酵，结合代谢通量平衡模型定量分析中心碳代谢通量分布。结果显示，pH 6.5时γ-PGA产量最高达76.12 g/L，产率约4.5 g/(L·h)，此时胞外谷氨酸摄取速率（45.9 mmol gDCW⁻¹ h⁻¹）和γ-PGA生成速率（121.0 mmol gDCW⁻¹ h⁻¹）均最高；pH 5.7时acetoin为主要副产物（最高24.7 g/L），大量碳流（46.1%）被导向副产物合成，γ-PGA产率降至约3 g/(L·h)；pH 7.3则促进2,3-BDO积累。该工作明确了pH通过调控副产物代谢模式来重新分配碳流、进而影响γ-PGA合成的机制，为通过敲除副产物合成基因或优化发酵pH策略提升产量提供了重要的理论依据。
创新点
首次确认B. subtilis ZJU-7的主要副产物是acetoin和2,3-BDO，并系统评估其毒性；将副产物合成途径纳入代谢网络模型，定量分析不同pH下通量再分配，阐明了pH通过改变副产物模式影响γ-PGA合成的机制。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis ZJU-7 (CGMCC1250) | γ-PGA生物合成 | — | — | 催化 | γ-PGA生产菌株，以葡萄糖和谷氨酸为底物，具有高产γ-PGA能力（可达80 g/L）。 |
| Bacillus subtilis ZJU-7 | 糖酵解途径 | — | — | 催化 | 中心碳代谢主要途径，为细胞生长和γ-PGA合成提供前体（丙酮酸、乙酰辅酶A等）及ATP/NADH。 |
| Bacillus subtilis ZJU-7 | 磷酸戊糖途径 | — | — | 催化 | 产生NADPH和五碳糖中间体，NADPH参与细胞内合成代谢。 |
| Bacillus subtilis ZJU-7 | 三羧酸循环 | — | — | 催化 | 提供α-酮戊二酸作为内源谷氨酸合成前体，并通过氧化还原反应产生能量。 |
| Bacillus subtilis ZJU-7 | 副产物合成途径（acetoin和2,3-BDO） | — | — | 催化 | 由丙酮酸衍生的厌氧支路，在低溶氧条件下激活，消耗碳源并产生抑制性副产物。 |
关键发现
- 在pH
- 5时γ-PGA产量最高达76.12 g/L，副产物acetoin仅1.17 g/L、2,3-BDO为7.52 g/L；pH
- 7时acetoin为主要副产物，最高积累24.7±0.92 g/L（38 h），而pH
- 5和7.3时2,3-BDO为主要副产物，最高约25 g/L。外源添加2 g/L acetoin使菌体量降至约3 g/L（对照的25%），5 g/L几乎完全抑制细胞生长；添加30 g/L 2,3-BDO使γ-PGA产量降至15.36±0.62 g/L（对照29.06±1.27 g/L）。代谢通量分析表明，pH
- 5时胞外谷氨酸摄取速率（45.9 mmol gDCW^-1 h^-1）、内源谷氨酸合成速率（78.0 mmol gDCW^-1 h^-1）及γ-PGA生成速率（121.0 mmol gDCW^-1 h^-1）均最高；pH
- 7时分别为34.0、46.0和80.0 mmol gDCW^-1 h^-1，同时46.1的碳流进入acetoin。pH
- 5时γ-PGA产率约4.5 g/(L·h)，pH
- 7降至约3 g/(L·h)。
研究结论
acetoin和2,3-BDO是B. subtilis ZJU-7发酵生产γ-PGA的主要副产物，二者均对γ-PGA合成有负面作用。pH是调控副产物代谢模式和代谢流分配的关键因素：低pH（5.7）激活acetoin合成，抑制细胞生长；高pH（7.3）促进2,3-BDO生成，消耗碳源。pH 6.5最有利于碳流进入γ-PGA合成途径，是实现高产的适宜pH。研究为通过基因工程敲除副产物合成基因或优化发酵策略提升γ-PGA产量提供了理论依据。