Heterologous expression of pentalenene synthase (PSS) from Streptomyces UC5319 in Xanthophyllomyces dendrorhous
- 作者
- Elena Melillo, Remco Muntendam, Wim J. Quax, Oliver Kayser
- 单位
- Department of Pharmaceutical Biology, Groningen Research Institute of Pharmacy, University of Groningen; Department of Technical Biochemistry, Technical University of Dortmund
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2012.05.024
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Xanthophyllomyces dendrorhous 作为天然产虾青素的酵母，尚未被用于异源表达萜类环化酶；需验证其作为萜类化合物生产平台的潜力。
研究策略
构建两种重组载体，分别通过同源重组敲除类胡萝卜素合成基因 crtE 或 crtYB，同时插入来源于 Streptomyces UC5319 的 pentalenene synthase (PSS) 基因；另构建基于 rDNA 整合的 pPR-PSS 载体，实现多拷贝整合。利用 dodecane 原位捕获挥发性产物并用 GC-MS 检测。
核心内容
该研究首次在产虾青素的酵母Xanthophyllomyces dendrorhous中异源表达了来自链霉菌UC5319的pentalenene合成酶基因，验证其作为萜类化合物生产平台的可行性。研究者构建了三种重组载体，分别通过同源重组敲除类胡萝卜素合成关键基因crtE或crtYB并插入PSS基因，以及利用rDNA整合实现多拷贝表达，同时采用十二烷原位捕获挥发性产物并结合GC-MS检测。结果显示所有PSS表达菌株均产生pentalenene，而野生型和敲除菌株无此产物，GC-MS鉴定特征碎片m/z 204（68%）和m/z 189（47.6%）。ΔcrtE-PSS和ΔcrtYB-PSS菌株产量为0.25至0.68 mg/L，而通过rDNA整合并在高浓度遗传霉素下筛选的菌株产量可达4.8 mg/L，相当于每克干酵母产0.37 mg pentalenene。所有突变株类胡萝卜素完全缺失（白色菌落），但生长曲线与野生型无显著差异。研究证明敲除内源类胡萝卜素途径可有效将碳通量导向异源萜类产物，且产量受限于基因表达水平而非前体供给，表明该酵母具备进一步工程化改造生产萜类药物的潜力。
创新点
首次在 X. dendrorhous 中功能性表达异源萜类环化酶；通过敲除内源类胡萝卜素途径使碳通量导向目标萜类产物；开发了三种不同的基因整合策略。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous (CBS 6938, ATCC 96594) | 萜类/类胡萝卜素合成 | — | — | — | 宿主菌株，野生型产虾青素 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素合成 | crtE | geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPPS) | 催化 | 敲除后阻断类胡萝卜素合成，使 FPP 流向 pentalenene |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素合成 | crtYB | phytoene synthase / lycopene cyclase | 催化 | 敲除后阻断类胡萝卜素合成，产生白色菌落 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 倍半萜合成 | PSS | pentalenene synthase | 催化 | 异源表达，催化 FPP → pentalenene，来自 Streptomyces UC5319 |
关键发现
- 所有 PSS 表达菌株均能产生 pentalenene，野生型及敲除菌株无该产物；GC-MS 鉴定 pentalenene 特征碎片 m/z 204（68%）和 m/z 189（47.6%）。ΔcrtE-PSS 和 ΔcrtYB-PSS 产量为
- 25–0.68 mg/L，pPR-PSS 产量更高；在更高遗传霉素浓度下筛选到的菌株产量可达
- 8 mg/L，相当于
- 37 mg pentalenene/g 干酵母。所有突变株与野生型生长曲线无显著差异，类胡萝卜素完全缺失（白色菌落）。
研究结论
X. dendrorhous 能够作为异源萜类环化酶的表达宿主，敲除类胡萝卜素途径后可将前体导向异源萜类生产；其产量受限于基因表达水平而非前体供给，表明该酵母具有进一步工程化改造生产萜类药物的潜力。