Regulation of alcohol oxidase 1 (AOX1) promoter and peroxisome biogenesis in different fermentation processes in Pichia pastoris
- 作者
- Sehoon Kim, Shannon Warburton, Istvan Boldogh, Cecilia Svensson, Liza Pon, Marc d'Anjou, Terrance A. Stadheim, Byung-Kwon Choi
- 单位
- GlycoFi, Biologics Discovery, Merck & Co., Inc, 16 Cavendish Ct., Lebanon, NH 03766, USA; Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, 630 W. 168th Street, New York, NY 10032, USA
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2013.05.009
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
在毕赤酵母中，不同发酵工艺条件（甲醇限制、碳源切换、氧限制）下AOX1启动子调控和过氧化物酶体生物发生的差异，及其对重组蛋白生产的影响。
研究策略
利用短寿命GFP（Ub-R-GFP）和过氧化物酶体靶向GFP（GFP-SKL）分别实时监测AOX1启动子活性和过氧化物酶体动态，并以单克隆抗体为报告蛋白，比较三种补料分批工艺（ML、SML、OL）。
核心内容
本研究利用短寿命荧光蛋白Ub-R-GFP和过氧化物酶体靶向GFP-SKL，在毕赤酵母中实时监测不同补料分批发酵工艺下AOX1启动子活性与过氧化物酶体动态，并以单克隆抗体为报告蛋白比较甲醇限制（ML）、连续/切换（SML）和氧限制（OL）三种工艺。结果显示，ML条件下启动子活性在诱导36小时达到峰值630.7 RFU后下降，而OL稳定在约160 RFU；过氧化物酶体荧光强度在ML为428–484 RFU，远高于OL的41–107 RFU，且与甲醇消耗速率直接相关。ML在86小时诱导内抗体比产率更高，滴度为OL的1.6倍，但细胞裂解更严重；OL虽产率较低，却能稳定延长至180小时，最终抗体滴度达600 mg/L，为ML的1.3倍。研究表明甲醇和氧气可得性共同调控AOX1启动子与过氧化物酶体生物发生，甲醇消耗速率是决定表达水平的关键因素；OL工艺更适合长时稳健生产，ML适合短时高产，GFP报告系统为工艺优化提供了有力工具。
创新点
['首次使用短寿命Ub-R-GFP定量监测不同工艺条件下AOX1启动子的时间动态活性', '揭示过氧化物酶体生物发生与甲醇消耗速率直接相关', '证明氧限制工艺（OL）因细胞裂解低、存活率高而适合长时诱导，甲醇限制工艺（ML）在短时诱导内产率更高']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris (glyco-engineered) | 甲醇利用通路 | AOX1 | Alcohol oxidase 1 | 催化 | 催化甲醇氧化为甲醛和过氧化氢，是甲醇代谢第一步 |
| Pichia pastoris | 甲醇利用通路 | AOX1 promoter | — | 调控 | 受甲醇诱导、葡萄糖抑制，控制AOX1及重组蛋白表达 |
| Pichia pastoris | 过氧化物酶体生物发生 | GFP-SKL | GFP-SKL融合蛋白 | 区室化 | SKL信号肽引导GFP靶向过氧化物酶体，用于定量过氧化物酶体生物发生 |
| Pichia pastoris | 过氧化物酶体生物发生 | GAPDH promoter | — | 调控 | 组成型启动子用于表达GFP-SKL，以独立于AOX1启动子的方式标记过氧化物酶体 |
关键发现
- ['ML条件下Ub-R-GFP荧光强度从诱导起点0增至36h的630.7±73 RFU，随后84h降至459.0±45 RFU
- OL条件下维持在约160±11 RFU', '过氧化物酶体GFP荧光强度在ML为428-484 RFU，OL为41-107 RFU', '甲醇比消耗速率：ML为3.5±0.2 mg g^-1 h^-1，OL为2.5±0.2 mg g^-1 h^-1', '单克隆抗体比产率（q_p）在86h诱导时：ML为0.026 mg g^-1 h^-1，OL为0.020 mg g^-1 h^-1', '87±2h诱导内抗体滴度ML为OL的1.6倍
- OL延长至180h可达600 mg/L，为ML最终滴度的1.3倍', '甲醇消耗产率（Y_p/m）ML为2.2±0.3 mg/g，OL为2.0±0.1 mg/g', 'ML条件下细胞裂解程度高于OL和SML']
研究结论
AOX1启动子活性和过氧化物酶体生物发生受甲醇和氧气可得性调节，甲醇消耗速率是决定重组蛋白表达水平的关键因素；氧限制工艺（OL）为稳健的长时生产方案，甲醇限制工艺（ML）在短时诱导内更具生产力；GFP报告系统为工艺优化提供了有效工具。