Characterization of a novel recombinant β-glucosidase from Sphingopyxis alaskensis that specifically hydrolyzes the outer glucose at the C-3 position in protopanaxadiol-type ginsenosides
- 作者
- Kyung-Chul Shin, Deok-Kun Oh
- 单位
- Department of Bioscience and Biotechnology, Konkuk University, Seoul 143-701, Republic of Korea
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2013.11.026
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
现有酶无法特异性地水解原人参二醇型人参皂苷C-3位外侧葡萄糖，导致稀有人参皂苷（如gypenoside XVII、化合物O等）难以高效、无副产物地生产。
研究策略
从Sphingopyxis alaskensis中克隆β-葡萄糖苷酶基因，在大肠杆菌中异源表达、纯化并表征其酶学性质；研究其对多种人参皂苷的底物特异性，并优化以人参皂苷Rb1为底物生产gypenoside XVII的反应条件。
核心内容
本研究从Sphingopyxis alaskensis中克隆了一个新的β-葡萄糖苷酶基因，并在大肠杆菌中异源表达、纯化及表征。该酶属于糖苷水解酶1家族，亚基分子量约51 kDa，天然形式为206 kDa的四聚体，最适pH为5.5、最适温度50°C，但40°C以上稳定性下降，因此实际操作温度选用40°C。底物特异性分析表明，该酶仅特异性水解原人参二醇型人参皂苷C-3位外侧葡萄糖的β-1,2糖苷键，不作用于C-20位糖基，可完全转化Rb1、Rb2、Rc、Rd生成gypenoside XVII、compound O、compound Mc1和F2，Rg3生成Rh2的摩尔转化率为89%。在优化条件下（pH 5.5、40°C、0.5 mg/mL酶、8 g/L Rb1），1小时产gypenoside XVII达6.8 g/L，摩尔转化率10%，生产力为6.8 g/L/h。该酶严格的位点特异性使其能够无副产物高效制备多种稀有人参皂苷，具备良好工业应用前景。
创新点
发现了一种仅特异性水解PPD型人参皂苷C-3位外侧葡萄糖（β-1,2糖苷键）的新β-葡萄糖苷酶，不水解C-20位糖基，能够完全转化多种主要人参皂苷生成相应稀有人参皂苷；并首次实现gypenoside XVII的高产（6.8 g/L/h）生物转化。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli ER2566 | — | — | — | — | 重组酶表达宿主菌 |
| — | PPD型人参皂苷C-3位外侧葡萄糖水解途径 | — | — | — | 生物转化途径 |
| — | — | β-葡萄糖苷酶基因（GenBank: ABF52736） | β-葡萄糖苷酶 | 催化 | 来自Sphingopyxis alaskensis，GH1家族，特异性水解PPD型人参皂苷C-3位外侧葡萄糖 |
关键发现
- 重组β-葡萄糖苷酶比活为233.3 U/mg，纯化6.3倍，回收率25%；亚基分子量约51 kDa，天然酶为206 kDa四聚体；最适pH
- 5，最适温度50°C，但40°C以上稳定性显著下降，故操作温度选40°C；对人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3的比活分别为233.3、126.8、113.2、151.7、30.5 U/mg；能完全转化Rb1→gypenoside XVII（4 h）、Rb2→compound O（5 h）、Rc→compound Mc1（7 h）、Rd→F2（6 h）；Rg3→Rh2摩尔转化率89%；在最优条件下（pH
- 5、40°C、0.5 mg/mL酶、8 g/L Rb1）1 h产gypenoside XVII
- 8 g/L，摩尔转化率10%，生产力6.8 g/L/h。
研究结论
S. alaskensis来源的β-葡萄糖苷酶是一种严格特异性水解PPD型人参皂苷C-3位外侧葡萄糖的糖苷水解酶1家族酶，可高效转化主要人参皂苷（Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3）生产相应的稀有人参皂苷（gypenoside XVII、compound O、compound Mc1、F2、Rh2），其中以Rb1生产gypenoside XVII的产率和生产力最高，具有工业应用潜力。