Improved 1,3-propanediol production by engineering the 2,3-butanediol and formic acid pathways in integrative recombinant Klebsiella pneumoniae
- 作者
- Zhe Wu, Zhe Wang, Guoqing Wang, Tianwei Tan
- 单位
- Key Laboratory of Bioprocess, College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, PR China
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2013.04.022
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
1,3-丙二醇生物合成中辅因子NADH不足和多种副产物（如2,3-丁二醇、甲酸等）抑制细胞生长并降低产量，且副产物增加下游纯化难度。
研究策略
采用整合型重组策略，通过插入四环素抗性基因和甲酸脱氢酶基因（fdh）灭活乙偶姻还原酶（AR）编码基因budC，在敲除2,3-丁二醇途径的同时引入FDH以消除甲酸并再生NADH，实现代谢通量再分布。
核心内容
本研究针对肺炎克雷伯氏菌生产1,3-丙二醇过程中NADH供应不足及副产物积累的问题，采用整合型重组策略对代谢网络进行改造。研究通过插入四环素抗性基因和甲酸脱氢酶基因，同时灭活乙偶姻还原酶编码基因budC并引入fdh，既阻断2,3-丁二醇合成途径，又促进甲酸分解并再生NADH，实现代谢通量的有利再分布。摇瓶实验中，重组菌株1,3-丙二醇产率达到0.74 mol/mol甘油，高于理论产率0.72；5 L补料分批发酵中，工程菌CF菌株的1,3-丙二醇终浓度达72.2 g/L，产率0.569 mol/mol，较野生型分别提高15.9%和21.7%。同时，2,3-丁二醇和甲酸效价分别降低52.2%和73.4%，非挥发性副产物总效价降至野生型的66.7%。酶活测定显示乙偶姻还原酶比活力从0.17 U/mg降至0.06 U/mg，甲酸脱氢酶比活力从0.0104 U/mg升至0.0530 U/mg。该整合型重组策略无需质粒维持抗性标记，在提升目标产物产量的同时显著简化下游纯化流程，为工业菌株开发提供了可行方案。
创新点
首次在整合型重组肺炎克雷伯氏菌中同时实现乙偶姻还原酶失活和甲酸脱氢酶表达，不仅降低2,3-丁二醇和甲酸，还大幅降低所有非挥发性副产物总效价，同时提高1,3-丙二醇产量，且无需质粒维持抗性标记。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella pneumoniae | 2,3-丁二醇合成途径 | budC | 乙偶姻还原酶 (AR) | 催化 | 通过插入Tet或fdh基因失活budC，消除AR活性，减少2,3-丁二醇生成。 |
| Klebsiella pneumoniae | 甲酸分解及NADH再生途径 | fdh | 甲酸脱氢酶 (FDH) | 催化 | 来自Pichia pastoris，催化甲酸氧化为CO2并再生NADH，同时降低甲酸抑制。 |
关键发现
- 摇瓶发酵中1,3-PD产率达0.74 mol/mol甘油，高于理论产率0.72
- 5 L补料分批发酵中，K. pneumoniae CF菌株1,3-PD终浓度达72.2 g/L，产率0.569 mol/mol，分别比野生型提高15.9%和21.7%
- 2,3-BD和甲酸效价分别降低52.2%和73.4%
- 非挥发性副产物总效价27.0 g/L，为野生型的66.7%
- AR比活力从0.17 U/mg降至0.06 U/mg，FDH比活力从0.0104 U/mg升至0.0530 U/mg
- CF菌株产量为8.89 g/L（摇瓶），CDW为野生型的164.9%（5 L发酵）。
研究结论
通过灭活乙偶姻还原酶并表达甲酸脱氢酶，实现了肺炎克雷伯氏菌代谢通量的有利再分布，提高1,3-丙二醇产率并大幅减少副产物，该整合型重组策略可有效降低下游纯化成本，为工业菌株改造提供重要参考。