Specificity of Ocimum basilicum geraniol synthase modified by its expression in different heterologous systems
- 作者
- Marc J.C. Fischer, Sophie Meyer, Patricia Claudel, Mireille Perrin, Jean François Ginglinger, Claude Gertz, Jean E. Masson, Danièle Werck-Reinhardt, Philippe Hugueney, Francis Karst
- 单位
- Univ Strasbourg, INRA, Inst Natl Recherche Agron, Metab Second Vigne, Unit Mixte Recherche Santé Vigne & Qual Vins, 28 rue de Herrlisheim, F-68021 Colmar, France; Biologie du Développement de la Vigne, INRA, Inst Natl Recherche Agron Unit Mixte Recherche Santé Vigne & Qual Vins, 28 rue de Herrnisheim, F-68021 Colmar, France; Institute of Plant Molecular Biology of CNRS UPR2357, University of Strasbourg, 28 rue Goethe, F-67000 Strasbourg, France
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2012.10.012
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
不同异源表达系统对同一植物单萜醇合酶（甜罗勒香叶醇合酶GES）产物特异性的影响，以及宿主细胞背景是否导致酶催化产物谱的改变。
研究策略
将甜罗勒（Ocimum basilicum）香叶醇合酶（GES）分别在葡萄（Vitis vinifera）愈伤组织再生植株、拟南芥（Arabidopsis thaliana）转基因植株、烟草（Nicotiana benthamiana）瞬时表达、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和大肠杆菌（Escherichia coli）中异源表达，通过GC-MS分析叶片或培养液中的单萜醇组成和含量，比较不同宿主中的产物谱差异。
核心内容
本研究将甜罗勒香叶醇合酶（GES）分别在葡萄愈伤组织再生植株、拟南芥转基因植株、烟草瞬时表达体系、酿酒酵母及大肠杆菌中异源表达，通过GC-MS分析各宿主叶片或培养液中的单萜醇组成，系统比较产物谱差异。结果显示，植物宿主中葡萄和烟草分别产生93%和95%的香叶醇，伴随3%香茅醇或芳樟醇等次要产物，而拟南芥中仅检测到香叶醇，含量为18.7±7.5 μg/g叶片；微生物宿主中大肠杆菌产物谱最宽，含36.5%香茅醇和11%橙花醇，香叶醇产量7.85±1.2 μg/g鲜重，酿酒酵母工程菌A9D的香叶醇产量最高达449±188 μg/g鲜重，次要产物比例也因菌株而异。对照实验排除外源香叶醇转化为副产物的可能。该结果说明宿主细胞背景能显著影响单萜醇合酶的催化特异性，可能通过改变细胞内碳正离子中间体分布来拓宽产物谱，意味着酶功能优化需综合考虑表达环境而不仅是氨基酸序列。
创新点
系统比较了植物和微生物多种异源表达体系下同一单萜醇合酶的底物特异性和产物谱；发现宿主细胞背景能显著影响GES的产物谱，除主产物香叶醇外还产生不同种类和比例的次要单萜醇；提出了宿主细胞内不同碳正离子中间体分布导致产物多样性的假说。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Vitis vinifera (葡萄, 品种41B, 砧木) | 单萜醇生物合成 | ObGES (Ocimum basilicum geraniol synthase cDNA, 与GFP融合) | Geraniol synthase (GES) | 催化 | 稳定转基因，叶片中主要产物为香叶醇，次要产物为香茅醇和橙花醇 |
| Arabidopsis thaliana (拟南芥, Col-0) | 单萜醇生物合成 | ObGES (Ocimum basilicum geraniol synthase cDNA, 与GFP融合) | Geraniol synthase (GES) | 催化 | 稳定转基因，仅检测到香叶醇，无次要产物 |
| Nicotiana benthamiana (烟草) | 单萜醇生物合成 | ObGES (Ocimum basilicum geraniol synthase cDNA) | Geraniol synthase (GES) | 催化 | 农杆菌浸润瞬时表达，次要产物为芳樟醇和橙花醇 |
| Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母, 菌株A9D和A9K) | 单萜醇生物合成 | ObGES (Ocimum basilicum geraniol synthase cDNA, 缺失前28个氨基酸的截短形式) | Geraniol synthase (GES) | 催化 | A9D为工程菌，主要产物为香叶醇，次要产物为芳樟醇、香茅醇和痕量橙花醇；A9K为未改造菌株，产量极低 |
| Escherichia coli (大肠杆菌) | 单萜醇生物合成 | ObGES (Ocimum basilicum geraniol synthase cDNA) | Geraniol synthase (GES) | 催化 | 检测到香叶醇、芳樟醇、香茅醇和橙花醇，次要产物比例较高 |
关键发现
- 在葡萄（V. vinifera）中GES表达产物为93%香叶醇、3%香茅醇、4%橙花醇，香叶醇含量50.7±17.6 μg/g叶片
- 烟草（N. benthamiana）中为95%香叶醇、3%芳樟醇、2%橙花醇，香叶醇含量93.0±53.1 μg/g叶片
- 拟南芥（A. thaliana）中为100%香叶醇，无次要产物，香叶醇含量18.7±7.5 μg/g叶片。大肠杆菌（E. coli）中香叶醇产量为7.85±1.2 μg/g鲜重，产物含49%香叶醇、3.5%芳樟醇、36.5%香茅醇、11%橙花醇
- 酿酒酵母（S. cerevisiae）工程菌A9D中香叶醇产量为449±188 μg/g鲜重，产物含90%香叶醇、5%芳樟醇、5%香茅醇及痕量橙花醇
- 而未经改造的A9K菌株几乎不产生单萜醇。对照实验表明外源添加香叶醇不会转化为次要产物，检测阈值约0.1 μg/g叶片（S/N=3），定量阈值约0.3 μg/g叶片（S/N=10）。
研究结论
O. basilicum GES在不同异源系统中的产物谱差异表明，单萜醇合酶的功能特性不仅取决于酶蛋白氨基酸序列，还受宿主细胞背景（如细胞环境、翻译后修饰、内源还原酶、pH等）的显著影响。不同宿主可能诱导多种碳正离子中间体的形成，从而产生更宽谱的单萜醇产物。研究还提示，某些植物或微生物表达系统可能天然倾向于产生更多的单萜醇种类。