RecA-mediated SOS response provides a geraniol tolerance in Escherichia coli
- 作者
- Asad Ali Shah, Chonglong Wang, Sang-Hwal Yoon, Jae-Yean Kim, Eui-Sung Choi, Seon-Won Kim
- 单位
- Division of Applied Life Science (BK21 Program), PMBBRC, Gyeongsang National University; Industrial Biotechnology Research Center, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2013.07.023
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决大肠杆菌微生物生产牻牛儿醇（geraniol）时其毒性对宿主的抑制，以及牻牛儿醇耐受机制不明的问题，为开发耐受菌株提供依据。
研究策略
构建大肠杆菌MG1655基因组鸟枪文库，在牻牛儿醇胁迫下进行生长筛选，鉴定耐受基因recA；利用基因敲除、回补、SOS报告系统和重组修复缺陷突变体等解析RecA介导的SOS响应在牻牛儿醇耐受中的作用机制。
核心内容
本研究以大肠杆菌MG1655为对象，通过构建基因组鸟枪文库并在牻牛儿醇胁迫下筛选，鉴定出recA为关键耐受基因。单独过表达recA可使DH5α在4%(v/v)牻牛儿醇下的菌落形成效率提高约10⁴倍。基因敲除与回补实验证实recA缺失导致菌株极度敏感，而回补可恢复耐受。利用lexA3(ind⁻)突变体（SOS不可诱导）与lexA300(Def)（SOS组成型激活）的比较，证明SOS响应的诱导而非RecA本身是耐受所必需。牻牛儿醇处理可诱导sulA启动子驱动的RFP表达并引起细胞丝状化，表明其造成DNA损伤并激活SOS响应。进一步发现ΔrecB和ΔrecN突变体对牻牛儿醇敏感，而ΔxerC不敏感，说明耐受依赖于RecB/RecN介导的同源重组修复而非易错修复。37株经RecA质粒诱导获得的“耐受”菌在去除质粒后全部恢复敏感，排除了SOS诱变机制的参与。该研究揭示RecA介导的SOS响应通过同源重组修复牻牛儿醇引起的DNA双链断裂赋予耐受性，为构建RecA缺陷但SOS组成型激活的牻牛儿醇生产宿主提供了新策略。
创新点
['首次发现recA介导的SOS响应能赋予大肠杆菌牻牛儿醇耐受性', '揭示牻牛儿醇造成DNA损伤并诱导SOS响应，通过同源重组修复（RecB/RecN）而非易错修复实现耐受', '提出构建RecA缺失但SOS组成型激活的菌株作为牻牛儿醇生产宿主的策略']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli MG1655 | SOS响应/同源重组修复 | recA | RecA | 调控 | 在牻牛儿醇胁迫下诱导SOS响应，并通过LexA切割激活下游修复基因 |
| E. coli MG1655 | 同源重组修复 | recB | RecB | 催化 | 双链断裂修复的核心蛋白，缺失导致牻牛儿醇敏感 |
| E. coli MG1655 | 同源重组修复 | recN | RecN | 催化 | 参与单链断裂修复，缺失导致牻牛儿醇敏感 |
| E. coli MG1655 | SOS响应调控 | lexA | LexA | 调控 | SOS盒基因的转录抑制因子，其不可切割突变体使菌株对牻牛儿醇敏感 |
| E. coli MG1655 | 位点特异性重组 | xerC | XerC | 催化 | 缺失不影响牻牛儿醇耐受，排除其作用 |
关键发现
- 通过鸟枪文库筛选获得5个牻牛儿醇耐受克隆，其中pBBL1b-18使大肠杆菌DH5α在4%(v/v)牻牛儿醇下的菌落形成效率(CFE)提高约10^4倍
- 单独过表达recA即可达到相似耐受水平。recA敲除突变体对牻牛儿醇极度敏感，回补recA恢复耐受。lexA3(ind-)突变体（SOS不可诱导）与ΔrecA同样敏感，而lexA300(Def)（SOS组成型激活）耐受性等同野生型，recA430（LexA切割效率低）呈中间耐受。4%(v/v)牻牛儿醇处理野生型MG1655可诱导sulA启动子驱动的RFP表达并引起细胞丝状化，ΔrecA则无此现象。ΔrecB和ΔrecN突变体对牻牛儿醇敏感，而ΔxerC不敏感。37株经RecA质粒诱导获得的'耐受'菌在去除质粒后全部恢复敏感，表明SOS诱导的易错突变不参与耐受。
研究结论
RecA介导的SOS响应通过激活同源重组修复（由RecB和RecN执行）来修复牻牛儿醇引起的DNA损伤（推测为双链断裂），从而赋予大肠杆菌牻牛儿醇耐受性。该机制为工程化改造牻牛儿醇耐受生产菌株提供了新策略，建议采用RecA缺陷但SOS组成型激活的宿主。