Polycistronic expression of a β-carotene biosynthetic pathway in Saccharomyces cerevisiae coupled to β-ionone production
- 作者
- Jules Beekwilder, Harmen M. van Rossum, Frank Koopman, Frank Sonntag, Markus Buchhaupt, Jens Schrader, Robert D. Hall, Dirk Bosch, Jack T. Pronk, Antonius J.A. van Maris, Jean-Marc Daran
- 单位
- Plant Research International, Wageningen, The Netherlands; Platform Green Synthetic Biology, Delft, The Netherlands; Delft University of Technology, Department of Biotechnology, Julianalaan 67, 2628 BC Delft, The Netherlands; DECHEMA Forschungsinstitut, Frankfurt am Main, Germany; Centre for BioSystems Genomics, Wageningen, The Netherlands
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2013.12.016
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用酿酒酵母从葡萄糖从头合成β-紫罗兰酮，并解决多基因共表达的稳定性和协调性问题，探索2A多顺反子表达系统在酵母代谢工程中的应用。
研究策略
采用病毒T2A序列构建多顺反子表达载体，将Xanthophyllomyces dendrorhous的β-胡萝卜素合成基因（crtYB、crtI、crtE）融合为一个开放阅读框，并在同一菌株中共表达植物来源的类胡萝卜素裂解双加氧酶RiCCD1，使β-胡萝卜素裂解产生β-紫罗兰酮；利用体内同源重组组装质粒，以十二烷作为有机相捕获挥发产物。
核心内容
本研究在酿酒酵母中利用病毒T2A多顺反子表达系统，将来自红发夫酵母的β-胡萝卜素合成基因crtYB、crtI和crtE融合为一个开放阅读框，并与植物来源的类胡萝卜素裂解双加氧酶RiCCD1共表达，以实现从葡萄糖从头合成β-紫罗兰酮。实验发现T2A序列在酵母中能有效介导多蛋白分离，而P2A无活性；通过同义密码子变异避免了2A重复序列引起的重组不稳定。多顺反子构建体在着丝粒和附加体质粒中均成功产生β-胡萝卜素，且24小时培养后菌株保持100%产色能力，而三启动子对照菌株有43%菌落丧失产色能力。在β-胡萝卜素产量上，基因组整合菌株达到1.94 mg/g cdw，附加体菌株为0.55 mg/g cdw。引入RiCCD1后，两相培养中β-紫罗兰酮产量为0.22 mg/g cdw，同时β-胡萝卜素产量下降65%，表明crtI可能是限速步骤。该研究首次在酿酒酵母中实现β-紫罗兰酮从头生物合成，建立了稳定的多基因共表达平台，为食品级香料及其他类胡萝卜素衍生化合物的微生物生产提供了新途径。
创新点
['首次验证T2A序列在酿酒酵母中介导功能性多顺反子表达，而P2A无活性', '首次在酿酒酵母中实现β-紫罗兰酮的从头生物合成', '通过同义密码子变异避免2A重复序列引起的重组不稳定，提高菌株稳定性', '建立了稳定的多基因共表达平台，可拓展至其他次级代谢产物']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK系列) | β-胡萝卜素生物合成途径 | crtYB | CrtYB | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous；双功能酶（植物烯合酶/番茄红素环化酶），催化GGPP→植物烯→番茄红素→β-胡萝卜素（环化） |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK系列) | β-胡萝卜素生物合成途径 | crtI | CrtI | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous；植物烯脱氢酶，催化植物烯→番茄红素 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK系列) | β-胡萝卜素生物合成途径 | crtE | CrtE | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous；GGPP合酶，催化FPP→GGPP |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK系列) | β-紫罗兰酮/类胡萝卜素裂解途径 | RiCCD1 | RiCCD1 | 催化 | 来自覆盆子Rubus idaeus；类胡萝卜素裂解双加氧酶，催化β-胡萝卜素→β-紫罗兰酮、植物烯→香叶基丙酮 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK系列) | 多顺反子共表达 | T2A序列 | T2A肽 | 调控 | 来自Thosaa asigna病毒；介导核糖体共翻译自切割，使单个转录本产生多个独立蛋白 |
关键发现
- T2A序列在酿酒酵母中有效介导GFP和LEU2-HA分离，Western blot检测到29.0 kDa GFP-2A和40.5 kDa Leu2-HA
- P2A无活性，检测不到分离产物。多顺反子crt构建体（crtYB-T2A-crtI-T2A-crtE）在着丝粒（IMCO18）和附加体（IME167）质粒中均产生β-胡萝卜素，菌落呈橙色
- Western blot确认crtYB-T2A（~65 kDa）、crtI-T2A（67 kDa）和未完全加工的多蛋白（144 kDa）存在。稳定性方面，24 h葡萄糖合成培养后，三启动子对照菌株YB/I/E有43%菌落失去产色能力，而IME167和IMCO18全部保持橙色。类胡萝卜素产量：IMCO18产生β-胡萝卜素0.35±0.01 mg/g cdw、植物烯1.6±0.02 mg/g cdw
- IME167产生β-胡萝卜素0.55±0.01 mg/g cdw、植物烯2.5±0.4 mg/g cdw
- 基因组整合的YB/I/E产生β-胡萝卜素1.94±0.66 mg/g cdw、植物烯6.5±2.0 mg/g cdw
- 附加体YB/I/E产生β-胡萝卜素0.55±0.02 mg/g cdw、植物烯1.8±0.03 mg/g cdw。引入RiCCD1后，在10%十二烷两相培养中，RiCCD1菌株生产β-紫罗兰酮0.22±0.06 mg/g cdw和香叶基丙酮0.86±0.03 mg/g cdw，而对照组IMCO18无这些产物
- 同时β-胡萝卜素产量降低65%（从0.51降至0.19 mg/g cdw），植物烯降低50%（从1.8降至1.0 mg/g cdw）。推测crtI是限速步骤，因为植物烯/β-胡萝卜素比例在2A菌株与三启动子菌株类似。
研究结论
成功构建了首个能从葡萄糖从头生产β-紫罗兰酮的酿酒酵母菌株，通过将覆盆子的RiCCD1与来自Xanthophyllomyces dendrorhous的类胡萝卜素合成途径（采用T2A多顺反子共表达）结合，实现了β-胡萝卜素的稳定合成及其向β-紫罗兰酮的裂解，为食品级香料及其他类胡萝卜素衍生化合物的微生物生产提供了新平台。