Molecular cloning and expression of fungal cellobiose transporters and β-glucosidases conferring efficient cellobiose fermentation in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Yi-Hyun Bae, Kyeong-Hyeon Kang, Yong-Su Jin, Jin-Ho Seo
- 单位
- Department of Agricultural Biotechnology and Center for Food and Bioconvergence, Seoul National University; Interdisciplinary Program for Bioengineering, Seoul National University; Department of Food Science and Human Nutrition, University of Illinois at Urbana-Champaign
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2013.10.030
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母纤维二糖发酵效率低，由于β-葡萄糖苷酶的转糖苷活性导致纤维寡糖积累，降低乙醇产量和得率，需发掘新的纤维二糖转运蛋白和β-葡萄糖苷酶以改善发酵性能。
研究策略
从纤维素分解真菌（里氏木霉、产黄青霉、嗜热毁丝霉）基因组中基于同源序列筛选候选纤维寡糖转运蛋白和β-葡萄糖苷酶基因，在酿酒酵母D452-2中按不同组合共表达，比较各工程菌株的纤维二糖发酵性能并筛选最优组合。
核心内容
该研究针对酿酒酵母纤维二糖发酵效率低的问题，从里氏木霉、产黄青霉和嗜热毁丝霉基因组中筛选候选纤维寡糖转运蛋白与β-葡萄糖苷酶基因，并在酿酒酵母D452-2中进行不同组合的共表达，比较各工程菌株的发酵性能。结果显示，首次报道的产黄青霉转运蛋白Pc.ST与嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶Tt.BG的组合表现最优：在微好氧批次发酵中，工程菌S. cerevisiae Pc.ST/Tt.BG达到乙醇浓度14.5±0.5 g/L，乙醇得率0.37±0.01 g/g纤维二糖，生产力0.30 g/L/h；相较对照菌Nc.CDT-1/Nc.GH1-1，乙醇产量提高约22%，得率提高约27%，且纤维三糖和纤维四糖等纤维寡糖积累显著减少。Tt.BG的比酶活是Nc.GH1-1的10倍。该组合通过高效的纤维二糖转运与水解，显著提升了底物利用效率和乙醇合成，为木质纤维素燃料乙醇生产提供了有效的菌株构建策略。
创新点
首次报道来源于Penicillium chrysogenum的糖转运蛋白Pc.ST与来源于Thielavia terrestris的β-葡萄糖苷酶Tt.BG的组合，显著提高纤维二糖发酵的乙醇产量和得率，并明显减少纤维三糖和纤维四糖等纤维寡糖的积累。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖发酵（纤维素乙醇生产） | Nc.CDT-1 | Neurospora crassa cellodextrin transporter CDT-1 | 转运 | 对照菌株已知的纤维寡糖转运蛋白，来自粗糙脉孢菌 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖发酵（纤维素乙醇生产） | Nc.GH1-1 | Neurospora crassa β-glucosidase GH1-1 | 催化 | 对照菌株β-葡萄糖苷酶，来自粗糙脉孢菌 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖发酵（纤维素乙醇生产） | Tr.ST | Trichoderma reesei sugar transporter | 转运 | 来自里氏木霉的候选糖转运蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖发酵（纤维素乙醇生产） | Tr.HT | Trichoderma reesei hexose transporter | 转运 | 来自里氏木霉的候选己糖转运蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖发酵（纤维素乙醇生产） | Pc.ST | Penicillium chrysogenum sugar transporter | 转运 | 来自产黄青霉的候选糖转运蛋白，最优组合之一 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖发酵（纤维素乙醇生产） | Tt.ST | Thielavia terrestris sugar transporter | 转运 | 来自嗜热毁丝霉的候选糖转运蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖发酵（纤维素乙醇生产） | Pc.BG | Penicillium chrysogenum putative β-glucosidase (hypothetical protein) | 催化 | 来自产黄青霉的候选β-葡萄糖苷酶 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖发酵（纤维素乙醇生产） | Tt.BG | Thielavia terrestris glycoside hydrolase family 1 β-glucosidase | 催化 | 来自嗜热毁丝霉的β-葡萄糖苷酶，最优组合之一，比酶活比Nc.GH1-1高10倍 |
关键发现
- 在微好氧批次发酵中，工程菌S. cerevisiae Pc.ST/Tt.BG达到最终乙醇浓度14.5±0.5 g/L，乙醇得率0.37±0.01 g/g纤维二糖，生产力0.30±0.01 g/L/h，纤维二糖消耗速率0.98±0.04 g/L/h
- 对照菌S. cerevisiae Nc.CDT-1/Nc.GH1-1相应值为12.5±0.4 g/L、0.31±0.03 g/g、0.26±0.01 g/L/h和0.99±0.08 g/L/h。Tt.BG的比酶活比Nc.GH1-1高10倍。Pc.ST/Tt.BG组合相比Nc.CDT-1/Nc.GH1-1，乙醇产量提高约22%，乙醇得率提高约27%（讨论部分描述），纤维低聚糖积累显著减少。
研究结论
通过筛选并组合表达最优的纤维二糖转运蛋白Pc.ST和β-葡萄糖苷酶Tt.BG，可显著提高酿酒酵母的纤维二糖利用效率和乙醇产量，减少纤维寡糖积累，为木质纤维素燃料乙醇生产提供了有效的菌株构建策略。