Molecular characterization of an aldo-keto reductase from Marivirga tractuosa that converts retinal to retinol
- 作者
- Seung-Hye Hong, Hyun-Koo Nam, Kyoung-Rok Kim, Seon-Won Kim, Deok-Kun Oh
- 单位
- Department of Bioscience and Biotechnology, Konkuk University, Seoul 143-701, Republic of Korea; Division of Applied Life Science, EB-NCRC and PMBBRC, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, Republic of Korea
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2013.11.005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
表征来自 Marivirga tractuosa 的醛酮还原酶（AKR）的分子酶学特性，实现其将全反式视黄醛（all-trans-retinal）还原为全反式视黄醇（all-trans-retinol）的生物转化，并阐明该酶不能催化逆反应的分子机制。
研究策略
将 M. tractuosa 的 AKR 基因克隆并在大肠杆菌中异源表达，纯化后测定其寡聚状态、底物/辅因子特异性及动力学参数；通过同源建模和定点突变，将辅因子结合位点的氨基酸残基替换为人类 AKR 的对应残基，解析决定氧化活性的关键残基。
核心内容
该研究将来自海生细菌Marivirga tractuosa的醛酮还原酶基因Ftrac_3685克隆并在大肠杆菌中异源表达，纯化后对其酶学性质进行了系统表征。该酶以约37 kDa亚基组成72 kDa二聚体，依赖NADPH催化全反式视黄醛还原为全反式视黄醇，对底物的kcat/Km达427 mM⁻¹ min⁻¹，但无法催化逆反应氧化视黄醇。在优化条件（pH 7.5、30°C、5%甲醇、10 mM NADPH、1710 mg/L底物）下反应80分钟，可生成1090 mg/L（3.8 mM）视黄醇，转化率64%，体积产率818 mg L⁻¹ h⁻¹。通过同源建模和定点突变，将辅因子结合位点的Ala158和Gln270分别替换为人类AKR的对应残基Ser和Glu后，突变体获得了对视黄醇的氧化活性。这一结果首次证明细菌来源AKR可高效不可逆地将视黄醛还原为视黄醇，为酶法生产维生素A提供了新催化剂，同时明确了控制逆反应活性的关键氨基酸位点。
创新点
首次报道细菌来源的 AKR 对全反式视黄醛的还原活性；发现该酶仅催化视黄醛还原为视黄醇而不具有逆反应活性，且对全反式视黄醛的催化效率最高（kcat/Km=427 mM^-1 min^-1）；通过定点突变确定 Ala158 和 Gln270 是决定 M. tractuosa AKR 不能利用 NADP+ 氧化视黄醇的关键残基。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli ER2566 | 异源蛋白表达 | Ftrac_3685 | 醛酮还原酶 (AKR) | 催化 | 用于克隆表达 M. tractuosa AKR 的重组酶 |
| Marivirga tractuosa | 视黄醛还原为视黄醇 | Ftrac_3685 | 醛酮还原酶 (AKR) | 催化 | AKR 基因来源菌株 |
| Escherichia coli ER2566 | 定点突变 | Ftrac_3685 (A158S) | 醛酮还原酶变体 (A158S) | 催化 | 获得对 all-trans-retinol 的氧化活性，对 all-trans-retinal 还原的 kcat/Km 为 703 mM^-1 min^-1 |
| Escherichia coli ER2566 | 定点突变 | Ftrac_3685 (Q270E) | 醛酮还原酶变体 (Q270E) | 催化 | 获得对 all-trans-retinol 的氧化活性，对 all-trans-retinal 还原的 kcat/Km 为 545 mM^-1 min^-1 |
关键发现
- 重组 M. tractuosa AKR 以 72 kDa 二聚体形式存在，亚基约 37 kDa
- 对全反式视黄醛的比活力为 319 nmol min^-1 mg^-1。动力学参数：对 all-trans-retinal，Km=48 μM，kcat=21.5 min^-1，kcat/Km=427 mM^-1 min^-1
- 对 9-cis-retinal，Km=225 μM，kcat=1.6 min^-1，kcat/Km=8 mM^-1 min^-1
- 对苯甲醛，kcat=446 min^-1，kcat/Km=294 mM^-1 min^-1
- 对乙醛，kcat=101 min^-1，kcat/Km=52 mM^-1 min^-1。最适反应条件：pH 7.5、30°C、5% (v/v) 甲醇、1% (w/v) 氢醌、10 mM NADPH、1710 mg/L 全反式视黄醛、3 unit/ml 酶。在此条件下反应 80 min，生成全反式视黄醇 1090 mg/L（3.8 mM），转化率 64% (w/w)，体积产率 818 mg L^-1 h^-1。NADPH 为唯一有效辅因子。定点突变表明，A158S 和 Q270E 变体获得对 all-trans-retinol 的氧化活性，其中 A158S 对 all-trans-retinal 还原的 kcat/Km 为 703 mM^-1 min^-1，Q270E 为 545 mM^-1 min^-1。
研究结论
M. tractuosa AKR 是一种 NADPH 依赖的醛还原酶，能高效地将全反式视黄醛还原为全反式视黄醇，且不可逆，因此可作为生物法生产视黄醇的有效催化剂。通过定点突变证明 Ala158 和 Gln270 是控制其逆反应活性的关键残基，为酶工程改造提供了依据。